通過BLAST方法,我們從GenBank中獲得了家豬面型干擾素PoIFN-?J,-入3的標準序列,并設計特異性引物,從豬腎細胞PK-15中調(diào)取了家豬千擾素PoIFN-、l,43的cDNA序列。使用軟件進行序列分析,并通過構(gòu)建不同物種的IFN-?^系統(tǒng)發(fā)生樹,揭示了各亞型么間的進化關系。為了進一步分析PoIFN-人家族的性質(zhì),構(gòu)建了pcDNA3.1/myc-戰(zhàn)s（-）B/PoIFN-、s真核表達載體,并進行表達及性質(zhì)研究。首先檢測了在BHK-21細胞中轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達情況,發(fā)現(xiàn)R)IFN-化分別具有1個及2個N端-糖基化位點。其次,鑒定了PoIFN-Xs在豬腎細胞舊RS-2及PK-15細胞中對poly I:C、FMDV、PRV的應答表達譜。此外,檢測了PoIFN-Xs在扭艮S-2中誘導抗病毒基因及細胞因子的表達情況,結(jié)果顯示PoIFN-?^可顯著誘導MX、OAS、PKR等ISGs及細胞因子正-6、TNF-a的表達。再者,抗病毒實驗表明,PoIFN-?^s在PK-15/PRV及IBRS-2/FMDV系統(tǒng)均具有低于P〇IFN-al2的抗病毒活性。本研究測定了化IFN-、-0),-S家族在... 

【文章來源】：復旦大學上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１：?ＩＦＮ表達模式及啟動子示意圖（ＫＯＴＥＮＫＯ?ＳＶ．，２０１１）??４??

ＩＦＮ－ＸＲ１表達，大約是角質(zhì)形成細胞的３倍；在Ｔ細胞，高表達量和低表達量均有??檢出，單核細胞也表現(xiàn)出很低的受體水平??所有的ＩＩ型細胞因子均能通過ＳＴＡＴｓ和ＪＡＫ途徑進行信號轉(zhuǎn)導（圖２）?Ｐ０１。配??體－受體復合物招募完成后，Ｊａｋｌ和Ｔｙｋ２介導受體鏈磯酸化，在含磯酸化酪氨酸??激酶基序的ＩＦＮ－化１胞內(nèi)區(qū)形成ＳＴＡＴ１和ＳＴＡＴ２的作用位點。Ｉ型或ｍ型干擾素??介導的信號傳遞導致轉(zhuǎn)錄因子復合物投Ｇ巧的形成；ＩＳＧＦ３聚合后將轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，??并與ＩＳＧｓ啟動子區(qū)域的ＩＳＲＥ相結(jié)合，從而誘導抗病毒活性，并在某些細胞上調(diào)??ＭＨＣ?Ｉ抗原的表達ＰＷ。除ＳＴＡＴ－ＪＡＫ途徑外，Ｉ型和曲型干擾素還可誘導其他信??５??

糖基化情況。真核表達的ＰｏＩＦＮ－Ｕ糖基化蛋白大小約為３０旺），未糖基化條帶約??為２５ｋＤ；?ＰｏＩＦＮ－？３完全糖基化蛋白大小約為３５ｋＤ，未糖基化條帶約為２０旺），??此外存在一條約３０吐）的不完全糖基化條帶（圖６）。運表明ＰｏＩＦＮ－Ｍ，－＞ｕ３分別??存在１個與２個糖基化位點，與軟件預測結(jié)果一致。???ｋＤａ?Ｍａｒｋｅｒ?Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＰｏｌＦＮ－?Ｘ?３?Ｐ〇ＩＦＮ－?Ｘ?１??３５－?’巧?‘?＇Ｐｉｊ＊??２５－?一??巧一顯．．??圖６．?ＩＦＮ上清Ｗｅｓ化ｒｎ－ｂｌｏｔ結(jié)果??蛋白分子量標記／實驗蛋白條帶分別在白光／化學發(fā)光模式拍攝。＋／－分別表示使用或未使用??Ｎ－糖基化抑制劑Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ處理，＊示糖基化蛋白條帶，＃示未糖基化蛋白條帶。??１．４．４?ＦｏＩＦＮ－Ｘｓ各亞型病毒誘導表達譜??病毒感染細胞后，通常會誘導干擾素的表達。為了解豬細胞對病毒誘導的曲??型ＩＦＮ應答，我們檢測了?ＦＭＤＶ、ＰＲＶ?Ｗ及ｐｏｌｙ?Ｉ：Ｃ處理細胞后，：ＰｏＩＦＮ－Ｍ，－入３??的ｍＲＮＡ水平。在陰性對照中，：ＰｏＩＦＮ－ａｌ２與化ＩＦＮ－Ｍ的表達量顯著高于??ＰｏＩＦＮ－？３的本底水平（未顯示）。在舊ＲＳ－２軸胞中，ｐｏｌｙ?Ｉ：Ｃ對ＰｏＩＦＮ－化－Ｘ３??有顯著誘導作用，且化高于２４１１，其中ＰｏＩＦＮ－、３表達量的升高最為明顯（圖７Ａ）；??ＦＭＤＶ可顯著誘導化ＩＦＮ－Ｍ表達


本文編號：3012248