本文關(guān)鍵詞：牛源金黃色葡萄球菌β-溶血素的真核表達(dá)及免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：奶牛乳房炎是一種能引起乳房炎癥的疾病,也是奶牛最為常見的疾病之一,它給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也給公共衛(wèi)生安全帶來了巨大的隱患。本研究?jī)?nèi)容和主要結(jié)果如下。1、對(duì)從奶牛乳房炎病例中分離的33株金黃色葡萄球菌進(jìn)行溶血素基因型和表型檢測(cè),并對(duì)它們之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明:hla、hlb、hld、hlg、hlg-2基因的檢出率分別為90.91%、100%、93.94%、78.79%、66.67%;金黃色葡萄球菌在牛血和綿羊血瓊脂平板上均以β溶血為主,但牛血檢測(cè)出的β溶血比例更高,溶血素基因型和表現(xiàn)型之間無(wú)對(duì)應(yīng)關(guān)系。2、將β-溶血素基因定向插入到pcDNA3.1 HisB載體上,成功構(gòu)建了重組的真核表達(dá)載體pcDNA3.1 HisB-hlb。用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞內(nèi),使用G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,用PCR、Western blot等方法檢測(cè)檢測(cè)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染情況。發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1 HisB-hlb已成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)并正確表達(dá)β-溶血素。3、用鎳柱親和層析法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,并測(cè)定純化后的β-溶血素對(duì)牛和綿羊紅細(xì)胞的溶血效價(jià),SDS-PAGE電泳顯示純化產(chǎn)物純度達(dá)電泳純,并在41.8KDa呈現(xiàn)單一條帶,對(duì)牛紅細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞的溶血比活分別為1658HU/mg和829HU/mg。4、分別將純化的β-溶血素和pcDNA3.1 His B-hlb與福氏佐劑乳化混合,制成亞單位疫苗和DNA疫苗,通過不同的途徑對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,強(qiáng)化免疫10天后,用ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、免疫球蛋白G、分泌性免疫球蛋白A和γ-干擾素等的濃度,同時(shí)用金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠攻毒,對(duì)免疫效果進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,各實(shí)驗(yàn)組的免疫球蛋白G(IgG)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)的濃度遠(yuǎn)大于對(duì)照組,差異顯著;β-溶血素和和pcDNA3.1HisB-hlb對(duì)小鼠均有一定的保護(hù)能力。
【關(guān)鍵詞】：奶牛 乳房炎 金黃色葡萄球菌 β-溶血素 真核表達(dá)載體 亞單位疫苗 DNA疫苗 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.611
【目錄】：

• 縮略詞對(duì)照表4-6
• 摘要6-7
• Summary7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-20
• 1 奶牛乳房炎危害12-15
• 1.1 奶牛乳房炎的危害12-13
• 1.2 金黃色葡萄球菌概述13-15
• 1.2.1 金黃色葡萄球菌的危害13
• 1.2.2 金黃色葡萄球菌毒力因子13-15
• 2 金黃色葡萄球菌 β-溶血素研究進(jìn)展15-17
• 2.1 金黃色葡萄球菌溶血素的分類15-16
• 2.2 金黃色葡萄球菌 β-溶血素的制備16-17
• 2.3 金黃色葡萄球菌 β-溶血素純化方法17
• 3 金黃色葡萄球菌疫苗研究進(jìn)展17-19
• 3.1 滅活苗17-18
• 3.2 亞單位疫苗18
• 3.3 重組載體疫苗18
• 3.4 合成肽疫苗18-19
• 3.5 基因疫苗19
• 3.6 基因缺失疫苗19
• 4 研究目的和意義19-20
• 第二章 實(shí)驗(yàn)研究20-57
• 實(shí)驗(yàn)一 溶血素基因型和表型相關(guān)性分析20-30
• 1 材料與方法20-23
• 1.1 菌株20
• 1.2 方法20-23
• 1.2.1 主要溶液的配制20-21
• 1.2.2 溶血素基因檢測(cè)21-23
• 1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成21
• 1.2.2.2 基因組DNA的提取21-22
• 1.2.2.3 PCR擴(kuò)增與凝膠電泳22-23
• 1.2.2.4 測(cè)序23
• 1.2.3 溶血性檢測(cè)23
• 2 結(jié)果23-28
• 2.1 基因組DNA提取結(jié)果23-24
• 2.2 溶血素基因檢測(cè)結(jié)果24
• 2.3 溶血性檢測(cè)結(jié)果24-25
• 2.4 溶血素基因型和表型相關(guān)性分析25-28
• 3 討論28-30
• 實(shí)驗(yàn)二 β-溶血素基因真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)30-44
• 1 材料與方法30-40
• 1.1 材料30
• 1.1.1 菌株與質(zhì)粒30
• 1.1.2 主要儀器和試劑30
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法30-40
• 1.2.1 主要溶液的配制30-32
• 1.2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1 HisB-hlb的構(gòu)建32-33
• 1.2.3 質(zhì)粒的提取33-34
• 1.2.4 pcDNA HisB-hlb的測(cè)序和酶切鑒定34
• 1.2.5 pcDNA HisB-hlb在MCF-7 中的表達(dá)34-35
• 1.2.5.1 MCF-7 的培養(yǎng)34-35
• 1.2.5.2 轉(zhuǎn)染MCF-735
• 1.2.6 反轉(zhuǎn)錄35-37
• 1.2.6.1 細(xì)胞總RNA的提取35-36
• 1.2.6.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA36-37
• 1.2.7 PCR檢測(cè)cDNA37
• 1.2.8 Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)37-40
• 1.2.8.1 細(xì)胞總蛋白的提取37-38
• 1.2.8.2 SDS-PAGE電泳38-39
• 1.2.8.3 轉(zhuǎn)膜39
• 1.2.8.4 封閉與抗體孵育39
• 1.2.8.5 顯色39
• 1.2.8.6 曝光39-40
• 2 結(jié)果40-43
• 2.1 pcDNA3.1 HisB-hlb合成結(jié)果40
• 2.2 pcDNA3.1 HisB-hlb的酶切鑒定40-41
• 2.3 MCF-7 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 HisB-hlb前后的觀察41-42
• 2.4 pcDNA3.1 HisB-hlb在MCF-7 中表達(dá)情況的檢測(cè)42-43
• 2.4.1 PCR檢測(cè)細(xì)胞總RNA42-43
• 2.4.2 Western blot檢測(cè)hlb的表達(dá)43
• 3 討論43-44
• 實(shí)驗(yàn)三：β-溶血素的純化及活性檢測(cè)44-49
• 1 材料與方法44-46
• 1.1 材料44
• 1.1.2 主要儀器和試劑見附錄44
• 1.2 方法44-46
• 1.2.1 蛋白濃度的測(cè)定44-45
• 1.2.2 β-溶血素的純化45-46
• 1.2.3 溶血效價(jià)的測(cè)定46
• 1.2.3.1 1%紅細(xì)胞懸液的制備46
• 1.2.3.2 溶血效價(jià)的測(cè)定46
• 2 結(jié)果46-47
• 2.1 β-溶血素純化結(jié)果46-47
• 2.2 溶血效價(jià)測(cè)定結(jié)果47
• 3 討論47-49
• 實(shí)驗(yàn)四：β-溶血素和重組質(zhì)粒對(duì)小鼠的免疫保護(hù)49-57
• 1 材料與方法49-53
• 1.1 材料49-50
• 1.1.1 菌株49
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物49
• 1.1.3 主要儀器49
• 1.1.4 主要試劑49-50
• 1.1.5 主要溶液的配制50
• 1.2 方法50-53
• 1.2.1 疫苗的制備和安全檢驗(yàn)50
• 1.2.2 動(dòng)物免疫50-52
• 1.2.3 免疫血清的制備52
• 1.2.4 ELISA實(shí)驗(yàn)52-53
• 1.2.5 攻毒實(shí)驗(yàn)53
• 2 結(jié)果53-55
• 2.1 疫苗的無(wú)菌和安全檢驗(yàn)53
• 2.2 ELISA測(cè)定結(jié)果53
• 2.3 免疫保護(hù)結(jié)果53-55
• 3 討論55-57
• 結(jié)論57-58
• 附錄58-63
• 一、β-溶血素序列58-59
• 二、所用試劑及試劑盒59-61
• 三、所用儀器61-63
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 致謝69-70
• 作者簡(jiǎn)介70-71
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介71-72

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3 魏春梅;牛源性重組金黃色葡萄球菌β-溶血素亞單位疫苗對(duì)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳腺內(nèi)感染小鼠的保護(hù)研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：301220