奶牛乳腺炎是世界范圍內影響奶牛業(yè)最大的疾病。在眾多能引起奶牛乳腺炎的病原中,S.aureus是危害最大的。由于抗生素的濫用和疫苗等生物制品的不健全導致乳腺炎的防治非常困難,而根本的原因還在于現(xiàn)階段人們對S.aureus乳腺炎的感染損傷機制還不清楚,因此探索S.aureus乳腺炎發(fā)生、發(fā)展與轉歸的分子機制迫在眉睫。中性粒細胞是奶牛乳腺抵御病原菌侵襲的第一道防線,它的凋亡對于控制乳腺炎癥的發(fā)展和轉歸至關重要,在解除奶牛不良炎性反應中發(fā)揮重要作用。為了探索奶牛S.aureus乳腺炎發(fā)生時中性粒細胞凋亡的分子機制,找到調控中性粒細胞凋亡的相關基因,本實驗在體外37℃,5%C02的條件下培養(yǎng)從奶牛外周血中分離到的中性粒細胞,向培養(yǎng)基中以50：1的比例加入處于對數(shù)生長期的S.aureus,分別在共培養(yǎng)Oh,2h,4h,6h,8h,10h后用PITC/PI雙染法通過流式細胞術檢測中性粒細胞凋亡情況。最后利用基因芯片技術篩選出與中性粒細胞凋亡相關的基因,并通過qPCR對芯片結果加以驗證。實驗所得結果有以下幾個方面：1、中性粒細胞體外培養(yǎng)存活情況體外培養(yǎng)的中性粒細胞的活細胞比例隨著培養(yǎng)時間的延長不斷下降... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1 文獻綜述
    前言
    1.1 奶牛S.aureus乳腺炎研究進展
        1.1.1 奶牛S.aureus乳腺炎的發(fā)病機制
        1.1.2 奶牛S.aureus乳腺炎的危害
        1.1.3 奶牛S.aureus乳腺炎的防治措施
    1.2 中性粒細胞凋亡與炎癥修飾
        1.2.1 中性粒細胞的凋亡現(xiàn)象
        1.2.2 中性粒細胞凋亡的影響因素
        1.2.3 中性粒細胞凋亡的分子改變
        1.2.4 中性粒細胞凋亡的誘發(fā)通路
        1.2.5 中性粒細胞凋亡與存活的調節(jié)
        1.2.6 中性粒細胞凋亡與炎癥反應
        1.2.7 中性粒細胞凋亡與S.aureus乳腺炎的關系
    1.3 基因芯片技術的研究進展
        1.3.1 基因芯片技術的原理
        1.3.2 基因芯片的主要類型
        1.3.3 基因芯片技術的主要步驟
        1.3.4 基因芯片技術的特點
        1.3.5 基因芯片技術的應用
2 目的與意義
3 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌種及實驗動物
        3.1.2 細胞
        3.1.3 培養(yǎng)基
        3.1.4 細胞提取試劑盒
        3.1.5 熒光定量PCR相關引物
        3.1.6 主要試劑
        3.1.7 主要儀器
    3.2 標準菌株的培養(yǎng)與計數(shù)
    3.3 中性粒細胞的提取、培養(yǎng)與鑒定
        3.3.1 中性粒細胞的提取
        3.3.2 中性粒細胞的培養(yǎng)
        3.3.3 中性粒細胞的計數(shù)
        3.3.4 中性粒細胞的鑒定
        3.3.5 中性粒細胞的存活曲線測定
    3.4 中性粒細胞的細菌感染實驗
    3.5 中性粒細胞凋亡的檢測
    3.6 S.aureus誘導中性粒細胞凋亡的基因表達譜測定
    3.7 芯片結果實時熒光定量PCR（qPCR）驗證
        3.7.1 細胞RNA的提取
        3.7.2 RNA的純化
        3.7.3 基因組DNA的除去反應
        3.7.4 cDNA的合成反應
        3.7.5 SYBR Green實時熒光定量PCR
        3.7.6 相對mRNA表達水平的計算
4 結果與分析
    4.1 中性粒細胞的鑒定結果
    4.2 中性粒細胞的存活曲線
    4.3 S.aureus誘導中性粒細胞凋亡情況
    4.4 樣品RNA質量檢測結果
    4.5 基因芯片結果
    4.6 qPCR驗證結果
5 討論
    5.1 中性粒細胞的培養(yǎng)
    5.2 中性粒細胞的凋亡與細菌感染
    5.3 S.aureus誘導中性粒細胞凋亡的相關基因表達情況
        5.3.1 Bcl-2基因
        5.3.2 IL1
6 結論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：2995652