發(fā)布時(shí)間：2021-01-20 20:55

　　為建立一種同時(shí)檢測(cè)牛輪狀病毒（BRV）和牛冠狀病毒（BCV）的方法,本研究根據(jù)GenBank中登錄的BRV VP6基因保守序列和BCV N基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針,通過方陣法優(yōu)化體系后,建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)BRV和BCV的雙重TaqMan熒光定量PCR方法。該方法與牛病毒性腹瀉病毒、牛細(xì)小病毒、牛腸道病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒均無交叉反應(yīng),特異性強(qiáng);敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,該方法對(duì)BRV和BCV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限分別為41.8拷貝/μL和3.55拷貝/μL,敏感性高;組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%,表明該方法重復(fù)性較好。利用建立的該方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室于2019年3月～9月在河北省內(nèi)采集的72份牛腹瀉糞便樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示BRV的陽性率為50.0%（36/72）,BCV的陽性率為75.0%（54/72）,BRV和BCV共感染率為33.3%（24/72）;而常規(guī)PCR的上述檢測(cè)結(jié)果分別為47.2%（34/72）、70.8%（51/72）,共感染率為29.1%（22/72）,二者對(duì)BRV和BCV檢測(cè)結(jié)果的陽性符合率分別為97.2%、96.8%,表明該方法可以用于臨床樣品的檢測(cè)。本研究建... 

【文章來源】：中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,42(10)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

熒光定量PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果

將BRV和BCV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成1.0×107拷貝/μL～1.0×100拷貝/μL后，經(jīng)雙重Taq Man熒光定量PCR檢測(cè)其敏感性。結(jié)果顯示，BRV和BCV的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限分別為4.18×101拷貝/μL和3.55×100拷貝/μL（圖4）；而常規(guī)PCR對(duì)BRV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限為4.18×104拷貝/μL，對(duì)BCV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出最低限為3.55×103拷貝/μL（圖5）。表明該方法敏感性優(yōu)于常規(guī)PCR，敏感性較高。2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

將BRV和BCV病毒核酸作為模板，利用BRV-F/BRV-R和BCV-F/BCV-R PCR擴(kuò)增后，分別在116 bp和139 bp出現(xiàn)和預(yù)期相符的目的條帶（圖1）。PCR產(chǎn)物純化回收后克隆至p MD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒p MD-BRV和p MD-BCV，測(cè)序結(jié)果顯示插入片段與預(yù)期一致，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)計(jì)算p MD-BRV和p MD-BCV的拷貝數(shù)分別為4.36×1010拷貝/μL和3.55×1010拷貝/μL。2.2 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：2989771