體細(xì)胞中導(dǎo)入特定的多能性轉(zhuǎn)錄因子可以將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells, iPS）。截止到目前,已成功的獲得人、牛、山羊、綿羊、小鼠、大鼠、猴、兔、豬等物種的iPS細(xì)胞。iPS細(xì)胞具有和胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells, ESC）類(lèi)似的多能性等特性,該技術(shù)對(duì)于難以建立胚胎干細(xì)胞系的動(dòng)物無(wú)疑提供了一種可行的替代方案。但是,最初建立iPS細(xì)胞的傳統(tǒng)方法是利用病毒載體將特定誘導(dǎo)因子Oct4、Sox2、Klf4和c-myc轉(zhuǎn)入體細(xì)胞內(nèi),病毒的轉(zhuǎn)染效率不能達(dá)到100%,獲得4個(gè)誘導(dǎo)因子同時(shí)表達(dá)的細(xì)胞比例很低,且病毒載體會(huì)隨機(jī)插入到體細(xì)胞的基因組中,可能導(dǎo)致正�；虻谋磉_(dá)受到影響,或引起基因突變并激活原癌基因的表達(dá)。質(zhì)粒載體、多蛋白表達(dá)系統(tǒng)、化學(xué)小分子以及轉(zhuǎn)座系統(tǒng)雖然盡可能地減少了外源基因和病毒元件的整合,使獲得iPS細(xì)胞的安全性獲得提高,但由于操作復(fù)雜、分析困難、制備效率低等原因制約著iPS細(xì)胞制備技術(shù)的發(fā)展。相比于以上制備iPS細(xì)胞技術(shù),mRNA誘導(dǎo)技術(shù)在理論上存在優(yōu)勢(shì)：一方面避開(kāi)了外源基因插入體細(xì)胞基因組的風(fēng)險(xiǎn)；... 

【文章來(lái)源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：85 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
符號(hào)表
前言
第一章 iPS細(xì)胞的研究進(jìn)展
    1 前言
    2 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)概述
        2.1 采用基因插入不可刪除型運(yùn)載系統(tǒng)誘導(dǎo)
        2.2 采用基因插入可刪除型運(yùn)載系統(tǒng)誘導(dǎo)
        2.3 采用無(wú)基因插入型運(yùn)載系統(tǒng)誘導(dǎo)
        2.4 采用無(wú)核酸參與型運(yùn)載系統(tǒng)誘導(dǎo)
    3 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)體系概述
        3.1 目的細(xì)胞的選擇
        3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)條件
            3.2.1 外源多能性轉(zhuǎn)錄因子的導(dǎo)入
            3.2.2 誘導(dǎo)過(guò)程中目的細(xì)胞的培養(yǎng)
            3.2.3 iPS細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
        3.3 iPS細(xì)胞的表觀(guān)遺傳學(xué)檢測(cè)
            3.3.1 分子水平
            3.3.2 細(xì)胞水平
            3.3.3 動(dòng)物水平
    4 iPS細(xì)胞的應(yīng)用前景
        4.1 構(gòu)建動(dòng)物模型
        4.2 建立疾病模型
        4.3 新藥發(fā)現(xiàn)及篩選
        4.4 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究
第二章 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因克隆
    1 材料和方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 菌種和質(zhì)粒來(lái)源
            1.1.2 引物、工具酶及試劑
            1.1.3 其他常用試劑配制
        1.2 方法
            1.2.1 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因克隆及鑒定
                1.2.1.1 山羊睪丸組織、皮膚組織和小腸組織總RNA提取
                1.2.1.2 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因cDNA的擴(kuò)增
                1.2.1.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
                1.2.1.4 菌液PCR擴(kuò)增目的基因
                1.2.1.5 質(zhì)粒DNA的提取
                1.2.1.6 去除內(nèi)毒素
                1.2.1.7 酶切鑒定
            1.2.2 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列測(cè)定及同源性分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的克隆
        2.2 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列測(cè)定及同源性分析
    3 討論
第三章 真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄因子體外轉(zhuǎn)錄
    1 材料和方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 材料
            1.1.2 引物、工具酶及試劑
            1.1.3 其他常用試劑配制
        1.2 方法
            1.2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建
            1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的體外轉(zhuǎn)錄
                1.2.2.1 質(zhì)粒純化
                1.2.2.2 mRNA“加帽”
                1.2.2.3 mRNA“加尾”
                1.2.2.4 mRNA純化
    2 結(jié)果與分析
        2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建
        2.2 轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的體外轉(zhuǎn)錄
    3. 討論
第四章 山羊iPS細(xì)胞誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系的優(yōu)化
    1 材料和方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 材料
            1.1.2 試劑
        1.2 方法
            1.2.1 GEF細(xì)胞及MEF細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            1.2.2 飼養(yǎng)層的制備
            1.2.3 培養(yǎng)液的配制
            1.2.4 山羊iPS細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)
            1.2.5 山羊iPS細(xì)胞的傳代、凍存與復(fù)蘇
            1.2.6 山羊iPS細(xì)胞的鑒定
                1.2.6.1 形態(tài)觀(guān)察
                1.2.6.2 AP染色
                1.2.6.3 免疫熒光檢測(cè)
    2 結(jié)果與分析
        2.1 GEF細(xì)胞和MEF細(xì)胞形態(tài)
        2.2 mRNA誘導(dǎo)山羊體細(xì)胞重編程成iPS細(xì)胞
        2.3 不同培養(yǎng)體系對(duì)山羊體細(xì)胞重編程的影響
        2.4 不同培養(yǎng)體系對(duì)山羊iPS細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
        2.5 最佳培養(yǎng)體系山羊iPS細(xì)胞干性檢測(cè)
            2.5.1 AP染色鑒定
            2.5.2 免疫熒光檢測(cè)
    3. 討論
第五章 山羊iPS細(xì)胞生物學(xué)特性及重編程機(jī)制研究
    1 材料和方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 材料
            1.1.2 試劑及引物
        1.2 方法
            1.2.1 GEF細(xì)胞及MEF細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            1.2.2 飼養(yǎng)層的制備
            1.2.3 培養(yǎng)液的配制
            1.2.4 山羊iPS細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)
            1.2.5 山羊iPS細(xì)胞的傳代、凍存與復(fù)蘇
            1.2.6 山羊iPS細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定
                1.2.6.1 形態(tài)觀(guān)察
                1.2.6.2 AP染色
                1.2.6.3 免疫熒光檢測(cè)
                1.2.6.4 類(lèi)胚體的制作
                1.2.6.5 RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)
                1.2.6.6 Western blot分析
                1.2.6.7 山羊iPS細(xì)胞的自發(fā)分化
                1.2.6.8 核型分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 利用mRNA體系誘導(dǎo)獲得山羊iPS細(xì)胞
        2.2 山羊iPS細(xì)胞具有典型的ES細(xì)胞形態(tài)和特異性標(biāo)記物的表達(dá)
        2.3 誘導(dǎo)過(guò)程中的重編程機(jī)制
        2.4 山羊iPS細(xì)胞的表觀(guān)遺傳狀態(tài)
        2.5 山羊iPS細(xì)胞具有在體外形成三種胚層細(xì)胞的能力
    3. 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
碩士期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]昆明小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化[J]. 任衛(wèi)青,張志平,許曉婷,鄧立新,李小佳,呂婧玉,翟明勝,王新莊.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2013(02)
[2]豬CatSperB和CatSperG基因的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)[J]. 宋成義,周家慶,馮曉軍,謝雨琇,李慶平,吳晗,高波,王霄燕.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(21)
[3]豬L-Myc基因的分子克隆及在細(xì)胞重編程中的應(yīng)用[J]. 李珍珍,崔怡,高祎,成德,劉亞軍,王華巖.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(17)
[4]利用piggyBac載體制備小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞[J]. 張金噸,趙麗霞,吳寶江,李云霞,張靜南,蘇杰,孫偉,戴雁峰,郭繼彤,胡樹(shù)香,李瑤,汪瑋,劉鵬濤,李喜和.  中國(guó)科學(xué):生命科學(xué). 2012(07)
[5]一種獲得豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的新方法[J]. 阮衛(wèi)民,韓建永,李品,曹素英,安楊,林賓,李寧.  中國(guó)科學(xué):生命科學(xué). 2011(05)
[6]阿拉伯馬染色體G帶核型分析[J]. 張靜南,劉永斌,張金噸,蘇杰,李云霞,孫偉,趙麗霞,郭繼彤,李喜和.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2011(02)
[7]飼養(yǎng)層和生長(zhǎng)因子對(duì)山羊類(lèi)胚胎干細(xì)胞的影響[J]. 崔雯,熊浩,王杏龍.  中國(guó)畜牧雜志. 2011(01)
[8]以?xún)煞N不同成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層培養(yǎng)牛胚胎干細(xì)胞的比較[J]. 靳木子,馬玉珍,倉(cāng)明,王瑞,任宇,劉東軍.  畜牧與獸醫(yī). 2010(06)
[9]無(wú)血清分離昆明系小鼠胚胎干細(xì)胞[J]. 余樹(shù)民,嚴(yán)興榮,陳冬梅,王晗,竇忠英.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(03)
[10]小鼠胚胎及人包皮成纖維細(xì)胞按比例制成混合飼養(yǎng)層上的人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)[J]. 李斌,彭秋平,盧偉英,徐雯,金應(yīng)霞,黃元華.  中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù). 2008(03)



本文編號(hào)：2980302