坦布蘇病毒（Tembusu Virus,TMUV）感染是由TMUV引起的一種新發(fā)傳染性疾病。該病自2010年起持續(xù)危害我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè),造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,1ncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸,缺乏編碼能力的RNA,最近大量研究報(bào)道其具有多種生物學(xué)功能,在病毒感染過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。為探究lncRNA在TMUV感染中的可能作用,本研究以鴨胚成纖維細(xì)胞（duck embryo fibroblast cells,DEFs）為試驗(yàn)材料,利用高通量RNA測(cè)序（RNA-Seq）技術(shù)揭示TMUV感染誘導(dǎo)的lncRNA表達(dá)譜變化,通過生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)差異表達(dá)1ncRNA的生物學(xué)功能,并對(duì)篩選的差異表達(dá)1ncRNA進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證和初步的功能研究。主要內(nèi)容如下:1、為探討TMUV感染DEFs后病毒的復(fù)制情況與宿主細(xì)胞的生物學(xué)特性變化,本研究利用DEFs為研究對(duì)象,分別接種3 MOI的TMUV,并在l2 hpi,24 hpi和48 hpi檢測(cè)病毒復(fù)制、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡三個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明,隨著病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞中的病毒滴度逐漸... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

黃病毒的結(jié)構(gòu)示意圖(Heinzetal.,2012)

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文9可以作為誘餌捕獲轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性(Bondetal.,2009)。例如，Evf-2可以作為關(guān)鍵激活因子激活參與轉(zhuǎn)錄過程的蛋白，調(diào)節(jié)同源盒轉(zhuǎn)錄因子2（DLX2）和熱休克蛋白（HSP）的轉(zhuǎn)錄(Fengetal.,2006)。除了作為正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，有一些1ncRNA也可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用。例如，周期蛋白D1（CCND1）能夠在病理狀態(tài)下產(chǎn)生多種lncRNA，它們能夠與RNA結(jié)合蛋白脂肪肉瘤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TLS），導(dǎo)致其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而使CCND1轉(zhuǎn)錄障礙，阻止了細(xì)胞進(jìn)程(Wangetal.,2008)。除了表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，1ncRNA能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，包括可變剪切、編輯、翻譯以及轉(zhuǎn)運(yùn)等mRNA事件(Moore.,2005)。在某些情況下，1ncRNA與己知蛋白編碼基因形成RNA互補(bǔ)雙鏈，成為mRNA的重疊基因中關(guān)鍵順式調(diào)控元件，導(dǎo)致正義鏈的可變剪切(Beltranetal.,2008)。1ncRNA可以通過調(diào)節(jié)翻譯過程在轉(zhuǎn)錄后水平增加蛋白質(zhì)的合成(Carrierietal.,2012;Liuetal.,2002)。有的1ncRNA通過改變蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位來(lái)調(diào)控蛋白活性(Willinghametal.,2005)。lncRNA也可以作為miRNA的海綿競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA，從而上調(diào)miRNA靶基因的表達(dá)(Hansenetal.,2013)。圖3lncRNA的功能模式(www.serengeseba.com)Fig.3ThefunctionpatternoflncRNA1.3.4lncRNA的作用機(jī)制1ncRNA可以作為信號(hào)分子、誘餌分子、支架分子和引導(dǎo)分子發(fā)揮基因調(diào)控作用。作為信號(hào)分子，1ncRNA的轉(zhuǎn)錄具有組織和時(shí)空特異性，可以在不同的細(xì)胞中對(duì)不同刺激做出特異性反應(yīng)。作為誘餌分子，1ncRNA能夠與染色質(zhì)修飾因子、轉(zhuǎn)錄因子以及剪切因子形成蛋白復(fù)合體，起到負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)器的作用，防止調(diào)節(jié)蛋白對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控(Martianovetal.,2007)。作為支架分子，1ncRNA可以將相關(guān)效應(yīng)分子組分組合成復(fù)合

坦布蘇病毒感染的鴨胚成纖維細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)譜變化及其功能初步研究20圖4RNA-Seq的流程Fig.4ProcessofRNA-Seq2.2.2.2原始數(shù)據(jù)的整理、過濾及質(zhì)量評(píng)估樣品通過上述RNA-Seq流程可以獲得下機(jī)數(shù)據(jù)，即原始數(shù)據(jù)（RawData）。通過統(tǒng)計(jì)各樣品的RawData，例如樣品名稱、模糊堿基所占百分比（N(%)）、堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基所占百分比（Q20(%)）、堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基總數(shù)（Q30）以及堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基所占百分比（Q30(%)）等，可以對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行初步評(píng)估。RawData中混有一部分帶接頭或者低質(zhì)量的序列，它們的存在對(duì)后續(xù)的生物信息學(xué)分析產(chǎn)生一定的誤差，因此有必要去除這些低質(zhì)量的數(shù)據(jù)。利用Cutadapt軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行接頭序列、低質(zhì)量序列和重復(fù)冗余序列的去雜。通過Bowtie2和Tophat2軟件建立參考基因組索引并將高質(zhì)量序列比對(duì)到參考基因組。Tophat2比對(duì)時(shí)，默認(rèn)序列和參考基因組序列的Mismatch在2個(gè)之內(nèi)，即為Mapping成功。如果Mapping比例大于70%，不僅說(shuō)明參考基因組選擇合格，而且能確定實(shí)驗(yàn)過程中沒有污染。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Analysis of Expression Profiles of Long Noncoding RNAs and mRNAs in A549 Cells Infected with H3N2 Swine Influenza Virus by RNA Sequencing[J]. Yina Zhang,Tianqi Yu,Yingnan Ding,Yahui Li,Jing Lei,Boli Hu,Jiyong Zhou.  Virologica Sinica. 2020(02)
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本文編號(hào)：2973794