為實現水貂阿留申病毒（Aleutian disease virus,ADV）部分VP2基因的可溶性表達,進一步探究目的蛋白的反應原性,本研究利用基因工程技術克隆ADV衣殼蛋白VP2部分基因,并亞克隆至原核表達載體pET30a（+）中,獲得重組表達載體pET-30a-M,經誘導表達后,SDS-PAGE確定蛋白表達形式,嘗試降低誘導溫度及誘導劑濃度來增加可溶性蛋白表達量,但效果不顯著;隨后,為增加可溶性表達,嘗試將pET-30a-M分別與pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16 5種伴侶蛋白共表達。通過SDS-PAGE篩選有效的伴侶蛋白,將伴侶蛋白pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16 5種質粒分別轉入感受態(tài)細胞BL21（DE3）,將pET-30a-M質粒分別轉入含各種伴侶蛋白的感受態(tài)細胞。各種共表達菌株經雙抗性篩選,誘導劑誘導表達,SDS-PAGE分析蛋白的表達情況。并從誘導溫度和伴侶蛋白誘導劑L-Arabinose劑量兩個方面篩選最佳表達條件。SDS-PAGE和Western blot分析結果表明重組表達載體pET-30a-M誘導表達后... 

【文章來源】：中國獸醫(yī)學報. 2020,40(09)北大核心

【文章頁數】：8 頁

【部分圖文】：

VP2部分基因片段的PCR擴增鑒定結果

重組質粒的雙酶切鑒定結果

在37℃、IPTG 1.0 mmol/L、誘導4 h的條件下,分析蛋白表達情況,SDS-PAGE結果顯示,與空載體全菌及誘導前的全菌相比,誘導后的全菌在約70 000處有明顯條帶,與預期的蛋白大小一致(圖3),蛋白主要以包涵體形式存在;在相同誘導時間(4 h)和IPTG誘導劑濃度(1.0 mmol/L)的條件下,分別以不同溫度16,25,30和37℃進行誘導表達,誘導4 h后,取出菌液,超聲破碎后,將超聲后的上清通過SDS-PAGE分析,結果顯示,溫度改變并不能有效增加可溶性蛋白表達(圖4)。在相同誘導時間(4 h)和誘導溫度(37℃)條件下,分別以0.1,0.2,0.4,0.6,0.8和1.0 mmol/L的IPTG進行誘導表達,利用SDS-PAGE分析誘導表達后超聲破碎的上清,結果顯示IPTG濃度的改變并不能有效增加可溶性蛋白的表達(圖5)。圖4 不同誘導溫度對蛋白表達的影響


本文編號：2970332