豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬的一種傳染病,臨床上主要表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸道癥狀及高死亡率。1987年美國首次發(fā)現(xiàn)該病,1996年我國首次分離到PRRSV （CH-1a株）。近二十年來,PRRS在我國多次爆發(fā),尤其是2006年我國出現(xiàn)的高致病性豬藍耳病病毒株,使該病在我國豬群中持續(xù)流行,給防控帶來很大挑戰(zhàn),也給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。親環(huán)蛋白家族各成員在生物體內(nèi)廣泛存在且高度保守,具有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶活性,通過催化含脯氨酸的寡肽底物的順反異構(gòu)幫助蛋白質(zhì)正確折疊和組裝。目前有超過60種的親環(huán)蛋白家族成員被發(fā)現(xiàn),其中親環(huán)蛋白A （CypA）作為免疫抑制藥物環(huán)孢素A （CsA）的細胞內(nèi)作用靶點最早從牛胸腺細胞中被分離出來,是親環(huán)蛋白家族最典型的代表,而且是最早發(fā)現(xiàn)且含量最豐富的親環(huán)蛋白家族成員。近年來,關(guān)于CypA的研究主要集中在其對病毒感染的作用上,如丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒1型、甲型流感病毒、輪狀病毒等。為探討CypA在PRRSV感染過程中的作用,我們開展了以下研究：1. PRRSV感染對CypA表達的影響... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第1章 文獻綜述
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒
        1.1.1 PRRS概述
        1.1.2 PRRSV病原學(xué)特征
        1.1.3 PRRSV基因組結(jié)構(gòu)特征
        1.1.4 PRRSV Nsp1β與天然免疫研究進展
        1.1.5 PRRSV與炎癥反應(yīng)
    1.2 CypA及其生物學(xué)功能
    1.3 CypA與炎癥
    1.4 CypA與腫瘤
    1.5 CypA與病毒感染
    1.6 蛋白質(zhì)相互作用的研究方法
第2章 研究目的和意義
第3章 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞、毒株與菌株
        3.1.2 載體與質(zhì)粒
        3.1.3 工具酶及主要試劑
        3.1.4 Western Blot以及CO-IP實驗所需材料
        3.1.5 培養(yǎng)基及其配制
        3.1.6 主要緩沖液與相關(guān)試劑及其配制
            3.1.6.1 構(gòu)建質(zhì)粒用緩沖液及其試劑
            3.1.6.2 Western Blot用緩沖液及其試劑
            3.1.6.3 其它緩沖液及其試劑
        3.1.7 主要實驗儀器及設(shè)備
        3.1.8 分子生物學(xué)分析軟件
    3.2 實驗方法
        3.2.1 原代PAM細胞的分離
        3.2.2 PRRSV的擴增（Marc-145及PAM細胞）
        3.2.3 病毒滴度的測定（空斑實驗）
        3.2.4 抑制劑的配制及其細胞毒性檢測
        3.2.5 細胞樣品總RNA的提取、RT-PCR及實時定量PCR
            3.2.5.1 總RNA的提取
            3.2.5.2 cDNA的合成
            3.2.5.3 SYBR Green Ⅰ實時定量PCR
            3.2.5.4 相對mRNA表達水平的計算
        3.2.6 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
        3.2.7 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的電泳檢測
        3.2.8 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的回收與純化
        3.2.9 外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
        3.2.10 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備（氯化鈣法）
        3.2.11 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.12 重組質(zhì)粒的制備與鑒定
            3.2.12.1 質(zhì)粒的小量制備
            3.2.12.2 質(zhì)粒的大量制備
            3.2.12.3 質(zhì)粒DNA的定量
            3.2.12.4 重組質(zhì)粒（陽性質(zhì)粒）的鑒定
        3.2.13 siRNA和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染法）
        3.2.14 雙熒光素酶報告基因檢測
        3.2.15 Western Blot檢測目的基因在真核細胞中的表達
            3.2.15.1 樣品制備
            3.2.15.2 SDS-PAGE電泳
            3.2.15.3 Western Blot檢測分析
        3.2.16 免疫共沉淀
            3.2.16.1 樣品制備及處理
            3.2.16.2 Western Blot檢測互作蛋白
        3.2.17 間接免疫熒光檢測蛋白質(zhì)的亞細胞定位
        3.2.18 酵母雙雜交篩選互作蛋白
            3.2.18.1 酵母感受態(tài)細胞的制備
            3.2.18.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞
            3.2.18.3 酵母融合質(zhì)粒的自激活檢測
            3.2.18.4 酵母融合質(zhì)粒的細胞毒性檢測
        3.2.19 統(tǒng)計學(xué)方法
第4章 結(jié)果與分析
    4.1 PRRSV感染對CypA的影響
        4.1.1 PRRSV感染對CypA表達的影響
        4.1.2 PRRSV感染對CypA細胞定位的影響
    4.2 CypA表達對PRRSV增殖的影響
        4.2.1 猴源CypA真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與CypA的表達驗證
        4.2.2 猴源CypA干擾分子的合成與驗證
        4.2.3 超表達及干擾CypA對PRRSV增殖的影響
        4.2.4 抑制劑CsA對PRRSV增殖的影響
            4.2.4.1 CsA對Marc-145和PAM細胞的毒性檢測
            4.2.4.2 Marc-145細胞中CsA對PRRSV增殖的影響
            4.2.4.3 PAM細胞中CsA對PRRSV增殖的影響
    4.3 CsA對PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響
        4.3.1 CsA抑制PRRSV感染誘導(dǎo)的MAPK信號通路
        4.3.2 CsA抑制PRRSV感染誘導(dǎo)的炎癥因子的表達
    4.4 與CypA相互作用的PRRSV編碼蛋白的確定
        4.4.1 CypA及PRRSV編碼蛋白酵母表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.4.2 與CypA相互作用的PRRSV編碼蛋白的篩選
        4.4.3 CypA與PRRSV Nsp1β相互作用的驗證
    4.5 與CypA相互作用的PRRSV Nsp1β結(jié)構(gòu)域的確定
        4.5.1 PRRSV Nsp1β截短突變體酵母表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.5.2 與CypA相互作用的PRRSV Nsp1β結(jié)構(gòu)域的篩選
        4.5.3 與CypA相互作用的PRRSV Nsp1β結(jié)構(gòu)域的驗證
    4.6 相互作用的蛋白及抑制劑CsA對IFN-β啟動子活性的影響
        4.6.1 CypA和抑制劑CsA對IFN-β啟動子活性的影響
        4.6.2 PRRSV Nsp1β截短突變體對IFN-β啟動子活性的影響
第5章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 PRRSV感染對CypA表達的影響
        5.1.2 CypA的表達對PRRSV的影響
        5.1.3 抑制劑CsA對PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響
        5.1.4 CypA與PRRSV相互作用機制的初步研究
        5.1.5 相互作用的蛋白及抑制劑CsA對IFN-β啟動子活性的影響
    5.2 結(jié)論
參考文獻
致謝



本文編號：2967708