CRISPR/Cas9技術(shù)是近年發(fā)展起來的基因定點修飾技術(shù),它有制作簡單、成本低、作用效果高等特點。精子載體法是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的一種簡單有效的方法。本研究探討將精子攜帶法和CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合,編輯獺兔的MSTN基因。本研究針對獺兔MSTN基因序列挑選2個靶位點,并設(shè)計出2對sgRNA,構(gòu)建出2個MSTN基因編輯載體。然后將MSTN基因敲除載體和精子混合,再經(jīng)過人工受精方法試圖編輯獺兔的MSTN基因。結(jié)果顯示:2個MSTN基因敲除載體構(gòu)建成功,載體重要元件沒有出現(xiàn)缺失。本試驗進行人工授精的母兔32只。共有11只母兔懷孕,其中有3只母兔臨產(chǎn)死亡。試驗中生產(chǎn)出47只仔兔,其中有10只仔兔因母兔臨產(chǎn)死亡導致沒有存活,經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)沒有得到基因編輯的獺兔。利用精子攜帶法能將基于CRISPR/Cas9技術(shù)編輯獺兔MSTN基因存在不穩(wěn)定性,本研究為進一步獲得MSTN基因編輯獺兔進行了探索,獲得了寶貴經(jīng)驗。 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：48 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

獺兔照片

圖 2 CRISPR/Cas9 工作機制Fig.2 The Working mechanism of CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9 的分類ISPR/Cas 系統(tǒng)中的 Cas 基因具有編碼核酸酶、聚合酶、解旋酶的作用，DNA 入侵起重要作用。根據(jù) Cas 蛋白之間進化保守性及功能等因素 系統(tǒng)分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[16]。Ⅰ型主要存在于細菌和古細菌；Ⅱ型只[24]；Ⅲ型大部分在古細菌發(fā)現(xiàn)，細菌中很少見過。和 III 型較為復雜，都具有 CRISPR/Cas 系統(tǒng)共有的重要特征，都包含特酶（Cas）和 guide RNA，且需要多種蛋白共同作用。其中，Ⅰ型含 6性蛋白是 Cas3 蛋白，其可形成 CRISPR 相關(guān)病毒防御復合物 Cascad成核糖核蛋白[25]，從而使 crRNA 與雙鏈 DNA 形成 R 環(huán)結(jié)構(gòu)。其中與 c由 Cas3 的核酸酶切開，另外一條由 Cas3 解旋酶和核酸酶切斷[26]。Ⅲ白，含有標志性的 RAMP 蛋白，具有 RNA 酶功能，參與 crRNA 的成熟

組水平主要分為三部分：5’端的tracrRNA基因、中間的多種編碼Cas蛋白基因（CCas1、Cas2 和 Csn2）、3’端的 CRISPR 基因座（包括啟動子區(qū)域、多個間隔序列-s及重復序列-repeats）。其中 tracrRNA 位點為反式調(diào)控激活 crRNA 位點（trans-actcrRNA，tracrRNA）。前體 crRNA（CRISPR-derived RNA）位點由間隔序列和重列相互間隔形成。Cas9 蛋白進行 crRNA 的加工及對入侵核酸的降解。tracrRNA工后的 crRNA 結(jié)合形成 RNA 二聚體，在 Cas9 蛋白的引導下對外源核酸進行特切割。

【參考文獻】：
期刊論文
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[4]用曲細精管微注射法建立綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠[J]. 沈新明,喬貴林,張玲,江培洲,黃華,姚開泰.  第一軍醫(yī)大學學報. 2002(03)
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[9]獺兔的毛色類型與品種特征[J]. 陶岳榮.  國外畜牧學(草食家畜). 1988(02)

博士論文
[1]不同被毛密度獺兔皮膚組織的差異表達基因篩選和CCNA2基因的多態(tài)性檢測及其與被毛密度的相關(guān)性研究[D]. 陳賽娟.河北農(nóng)業(yè)大學 2011
[2]山羊肌肉生長抑制素基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性能相關(guān)性研究[D]. 劉錚鑄.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 2006

碩士論文
[1]用精子載體法制備轉(zhuǎn)基因動物模型的研究[D]. 牟紅梅.西北農(nóng)林科技大學 2002



本文編號：2964096