發(fā)布時(shí)間：2020-12-13 20:09

　　柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）是一種寄生于雞盲腸的單細(xì)胞寄生原蟲,是雞球蟲病的主要病原體,目前國內(nèi)外對(duì)雞球蟲病的防治主要依靠藥物。長(zhǎng)期使用藥物使其對(duì)藥物表現(xiàn)出嚴(yán)重的抗性,給禽類的養(yǎng)殖帶來了大量的經(jīng)濟(jì)損失。為研究雞球蟲耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)室前期以柔嫩艾美耳球蟲的藥物敏感株（DS）為親本,誘導(dǎo)出抗地克珠利耐藥株（DZR）和抗馬杜拉霉素耐藥株（MRR）。對(duì)2個(gè)耐藥株和敏感株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,篩選了敏感株與耐藥株的差異表達(dá)基因。在此基礎(chǔ)上,本研究選擇4個(gè)在耐藥株體內(nèi)顯著上調(diào)的基因,分別為柔嫩艾美耳球蟲含HD域蛋白（HD domain-containing protein,EtHDCP）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,EtGAPDH）、伴侶蛋白TCP-1環(huán)狀復(fù)合物亞基α（T-complex protein 1 subunitα,EtTCP-1α）和蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase,EtMDH）。對(duì)這4個(gè)基因進(jìn)行特性和功能的初步分析,并用全基因組重測(cè)序的方法對(duì)敏感株和2個(gè)耐藥株進(jìn)行測(cè)... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

純化的柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)階段蟲體Fig.2.1Purified4developmentalstagesofEimeriatenellaA：孢子化卵囊（×200）；B：未孢子化卵囊（×200）；C：子孢子（×200）；D：裂殖子（×400）

經(jīng)凝膠電泳分析其完整性（圖2.2），可見提取的總 RNA 具有典型的 3 個(gè)條帶，表明提取的 RNA 未被降解，完整性較好。分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果 OD260/OD280=1.93，表明 RNA 未被蛋白質(zhì)和 DNA 污染，可進(jìn)行下一步的反轉(zhuǎn)錄，用反轉(zhuǎn)錄 M-MLV 試劑盒，得到柔嫩美耳球蟲孢子化卵囊的 cDNA 第一鏈，保存于-20℃。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 4 個(gè)耐藥相關(guān)基因的克隆和生物信息學(xué)分析因的 cDNA 片段。2.3.3.4 EtMDH 基因的 ORF 克隆根據(jù) EtMDH 基因 ORF 序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊 cDNA 為模板，設(shè)定合適的退火溫度進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)在 954 bp處有特異性的單一條帶（圖 2.3D），與預(yù)期條帶位置相符；將條帶位置正確的 PCR 產(chǎn)物切下，用膠回收試劑盒對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收。純化后的 PCR 產(chǎn)物與 pGEM-T-easy 載體 4℃條件下連接 8h 后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中，在 LB 固體平板中挑取陽性菌落進(jìn)行培養(yǎng)，并用 PCR 對(duì)菌液進(jìn)行鑒定和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與原序列比對(duì)正確，表明成功擴(kuò)增獲得 EtMDH 基因的 cDNA 片段。

【參考文獻(xiàn)】：
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