發(fā)布時間：2017-04-07 22:09

  本文關鍵詞：鵝TLR7和TLR21抗病毒免疫學特性及功能初探，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Toll樣受體作為一種重要的模式識別受體,能夠識別多種病原相關分子模式。大量研究報道表明,禽類的TLR3、TLR7與TLR21參與機體的抗病毒免疫反應。水禽鵝,作為許多病原的天然宿主,其抗病毒免疫反應值得做深入研究。本研究首次對鵝TLR7 (GoTLR7)與鵝TLR21 (GoTLR21)的抗病毒免疫學特性進行研究。通過使用低致病性禽流感病毒(H9N2)與鵝細小病毒(GPV)對3日齡雛鵝進行人工感染,檢測其主要免疫器官及其他相關器官發(fā)現(xiàn)：在感染H9N2病毒后的第3天到第7天,GoTLR7在肺組織的相對表達量顯著高于對照組,特別是在第7天其表達量上調(diào)了約5倍,但在第一天實驗組與對照組無顯著差異；在小腸組織中,兩組之間GoTLR21與GoTLR7表達量均無顯著差異。RIG-I受體作為另外一種非常重要的模式識別受體,負責識別病毒的特定RNA。在H9N2感染第3天鵝的肺和小腸組織中GoRIG-I表達量顯著高于對照組。在H9N2感染過程中,干擾素誘導小分子(MX,OAS, PKR)表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律：MX在所有組織中均無顯著變化；OAS在法氏囊、哈氏腺與肺組織的表達量顯著高于對照組；PKR在肺組織表達量顯著上調(diào),但其在胸腺組織顯著下調(diào)。GPV感染雛鵝后：GoTLR7在所有組織均無顯著變化；GoTLR21在脾臟和胸腺顯著升高,而在其他組織并無顯著變化；干擾素誘導的抗病毒小分子OAS在小腸組織表達量顯著高于對照組,而在其他組織無顯著變化；GoRIG-I、GoMX與GoPKR在各組織的相對表達量與對照組相比均無顯著差異。因此,結果表明GoTLR7與GoRIG-I參與宿主的抗H9N2流感病毒感染的免疫反應,并誘導抗病毒小分子的產(chǎn)生。GoTLR21參與宿主抗GPV病毒感染的免疫反應,誘導抗病毒小分子的產(chǎn)生。此外,我們還建立了體外感染模型,分別使用H9N2與GPV刺激鵝外周血單核細胞。用定量RT-PCR的方法檢測H9N2感染8h時GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游調(diào)控干擾素誘導小分子MX、OAS與PKR水平,結果顯示：實驗組GoTLR7與GoRIG-I的表達量顯著性升高,而GoTLR21無任何變化；干擾素誘導小分子MX呈現(xiàn)顯著下降,而OAS與PKR均表現(xiàn)出顯著上升。用定量RT-PCR的方法檢測GPV感染8h時GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游調(diào)控干擾素誘導小分子MX、OAS與PKR水平,結果顯示：GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游調(diào)控MX、OAS與PKR轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比均無顯著差異。結果表明GoTLR7與GoRIG-I在體外參與了抗H9N2流感病毒感染的免疫反應,并誘導抗病毒小分子的產(chǎn)生。GPV感染PBMC后,GoTLR21與其他免疫相關基因均無顯著性變化,我們猜測可能是由于GPV病毒需要更長的時間才能引起TLR21受體的識別,從而產(chǎn)生抗病毒因子,本實驗作用時間為8小時不能有效的誘導宿主經(jīng)由TLR21的抗病毒反應。為了進一步探討GoTLR7與GoTLR21是否具有抗病毒免疫學活性,我們構建了真核表達質(zhì)粒PEGFP-C1-GoTLR7與pDs-Red1-N1-GoTLR21并轉(zhuǎn)染傳代雞胚成纖維細胞(DF-1)10h,然后孵育新城疫病毒(New castle disease virus, NDV),經(jīng)絕對定量PCR反應及病毒滴度檢測而觀察轉(zhuǎn)染GoTLR7與GoTLR21質(zhì)粒是否對DF-1細胞中NDV的增殖或復制存在影響。GoTLR7與GoTLR21真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染DF-1細胞,而后孵育NDV病毒,研究結果顯示：孵育NDV病毒12h后轉(zhuǎn)染有GoTLR7細胞中NDV的復制受到顯著的抑制,而轉(zhuǎn)染GoTLR21并未對病毒增殖造成影響；孵育NDV病毒24h時,實驗組與對照組的病毒拷貝數(shù)均有所上升,但是轉(zhuǎn)染GoTLR7組中NDV拷貝數(shù)及TCIDso數(shù)值均顯著低于對照組,而轉(zhuǎn)染GoTLR21組中病毒增殖情況與對照組比較仍無顯著差異。因此,本實驗再次驗證GoTLR7參與抗RNA病毒免疫反應,并能抑制RNA病毒NDV的復制,而GoTLR21并不參與此反應。大量研究表明哺乳動物抗病毒TLR分布于細胞內(nèi)的核內(nèi)體。為了驗證禽類抗病毒TLR的細胞分布,我們將真核表達質(zhì)粒PEGFP-C1-GoTLR7分別轉(zhuǎn)染DF-1、GEF與BHK21。24h后對細胞核進行染色發(fā)現(xiàn)GoTLR7在DF-1、BHK21與GEF上的細胞定位不同,具體表現(xiàn)為：DF-1和BHK21細胞中GoTLR7熒光信號集中分布于細胞核一側,呈現(xiàn)極化狀態(tài)；而GEF細胞上GoTLR7熒光信號圍繞分布于細胞核周圍,非分布于細胞核一側。我們分別采集PEGFP-C1-GoTLR7轉(zhuǎn)染BHK21細胞24h、48h與72h時的圖片發(fā)現(xiàn)：GoTLR7的細胞定位隨表達時間發(fā)生了變化,具體表現(xiàn)為：24h時,GoTLR7分布于細胞核的一側,而在48h及72h, GoTLR7綠色熒光集中分布于遠離細胞核的胞質(zhì)內(nèi),呈現(xiàn)球形,推測其定位于某細胞器。將真核表達質(zhì)粒pDs-Redl-N1-GoTLR21分別轉(zhuǎn)染DF-1、GEF、MDCK與BHK21。24h后對細胞進行染色,發(fā)現(xiàn)在不同細胞類型上GoTLR21分布特征一致,均表現(xiàn)為緊緊圍繞于細胞核周圍。分別采集pDs-Red1-N1-GoTLR21轉(zhuǎn)染BHK21 24h、48h與72h的圖片發(fā)現(xiàn),GoTLR21的細胞定位隨表達時間也發(fā)生了變化。具體表現(xiàn)為：轉(zhuǎn)染24h時,GoTLR21紅色熒光表現(xiàn)為緊緊圍繞細胞核周圍,呈現(xiàn)圓圈狀特征,而在48h時發(fā)現(xiàn)其濃縮為圓點狀,且遠離細胞核分布,到72h時其形狀再次變?yōu)榄h(huán)形。因此,我們推測GoTLR7與GoTLR21也定位于細胞內(nèi)的細胞器上,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者核內(nèi)體上。綜上,本研究為鵝抗病毒TLR的抗病毒免疫學特性及生物學功能研究奠定基礎,為研發(fā)新型佐劑及抗病毒生物制劑提供理論基礎。
【關鍵詞】：GoTLR7 GoTLR21 細胞定位 抗病毒免疫學特性
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.33
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-13
• 第一部分 文獻綜述13-19
• 1 TLR7與TLR21的免疫學與生物學特點13-15
• 2 TLR7與TLR21抗病毒免疫學特性及細胞定位研究15-17
• 2.1 Toll樣受體抗病毒相關免疫學特性研究進展15-17
• 2.2 TLR7與TLR21的細胞定位研究進展17
• 3 本實驗的研究目的及意義17-19
• 第二部分 試驗研究19-54
• 第一章 H9N2與GPV對雛鵝先天性免疫基因的影響19-29
• 1 實驗材料20-21
• 1.1 實驗動物與毒株20
• 1.2 實驗儀器與設備20
• 1.3 實驗試劑20-21
• 2 實驗操作方法與步驟21-23
• 2.1 實驗動物分組及處理21
• 2.2 組織處理及RNA提取21-22
• 2.3 引物設計及RT-PCR實驗原理22-23
• 3 實驗結果23-27
• 3.1 H9N2病毒感染雛鵝引起的TLRs等相關免疫基因的表達量變化23-25
• 3.2 GPV病毒感染雛鵝引起的TLRs等相關免疫基因的表達量變化25-27
• 4 討論27-28
• 5 本章小結28-29
• 第二章 H9N2與GPV對鵝外周血單核細胞先天免疫基因的影響29-35
• 1 實驗材料29-30
• 1.1 實驗動物及毒株29
• 1.2 實驗儀器和設備29
• 1.3 實驗試劑29-30
• 2 實驗方法與操作30-31
• 2.1 鵝外周血單核細胞的分離及病毒感染30-31
• 2.2 RNA的提取及引物設計31
• 3 實驗結果31-33
• 3.1 H9N2低致病性禽流感感染鵝外周血單核細胞31-32
• 3.2 鵝細小病毒GPV感染鵝外周血單核細胞32-33
• 4 討論33-34
• 4.1 H9N2對鵝外周血單核細胞先天免疫分子的影響33-34
• 4.2 GPV對鵝外周血單核細胞先天免疫分子的影響34
• 5 本章小結34-35
• 第三章 GoTLR7與GoTLR21的抗NDV病毒活性初探35-45
• 1 實驗材料35-37
• 1.1 實驗毒株與細胞35
• 1.2 實驗儀器與設備35
• 1.3 實驗試劑35-36
• 1.4 相關溶液的配制36-37
• 1.5 DH5α感受態(tài)細胞的制作37
• 2 實驗方法與操作37-41
• 2.1 真核表達質(zhì)粒PEGFP-C1-GoTLR7的構建37-38
• 2.2 真核表達質(zhì)粒pDs-Red1-N1-GoTLR21的構建38-39
• 2.3 NDV病毒感染DF-1細胞步驟39-40
• 2.4 NDV拷貝數(shù)絕對定量檢測方法的建立40-41
• 2.5 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的NDV在DF-1細胞上的拷貝數(shù)與TCID_(50)的測定41
• 3 實驗結果41-43
• 3.1 NDV標準曲線41-42
• 3.2 瞬時過表達GoTLR7與GoTLR21對NDV拷貝數(shù)的影響42
• 3.3 瞬時過表達GoTLR7與GoTLR21對NDV TCID_(50)的影響42-43
• 4 討論43-44
• 5 本章小結44-45
• 第四章 鵝TLR7和TLR21的細胞定位研究45-54
• 1 實驗材料45-46
• 1.1 實驗試劑與細胞45
• 1.2 實驗儀器與設備45-46
• 2 實驗方法與操作46-49
• 2.1 GoTLR7細胞定位研究的實驗方法與步驟46-48
• 2.2 GoTLR21細胞定位研究的方法與步驟48-49
• 3 試驗結果49-52
• 3.1 GoTLR7在不同細胞類型上的細胞定位49
• 3.2 GoTLR7細胞定位隨轉(zhuǎn)染時間的變化49-50
• 3.3 GoTLR21在不同細胞類型上的細胞定位50-51
• 3.4 GoTLR21細胞定位隨轉(zhuǎn)染時間的變化51-52
• 4 討論52-53
• 5 本章小結53-54
• 第三部分 結論54-55
• 參考文獻55-59
• 致謝59-60
• 作者簡介及發(fā)表論文情況60
• 作者基本情況60
• 發(fā)表論文情況60

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本文編號：291421