牛屬于單胎動(dòng)物,在牛的一個(gè)發(fā)情周期中,卵巢內(nèi)一般只有一個(gè)卵泡會(huì)發(fā)育成熟并排卵,而卵巢上大量參與發(fā)育的卵泡則在其生長過程中就閉鎖凋亡。排卵率低一直是限制牛,羊等單胎動(dòng)物大規(guī)模繁育的關(guān)鍵因素。本課題組前期以母牛為研究對(duì)象,利用高通量深度測序技術(shù)篩選出10個(gè)與牛發(fā)情周期卵泡發(fā)育相關(guān)的基因,確定絲氨酸蛋白酶35(serine protease 35,PRSS35)與牛卵泡的發(fā)育相關(guān)。本試驗(yàn)以山西省文水縣肉牛屠宰場海福特牛卵巢作為研究對(duì)象,首先擴(kuò)增牛卵巢PRSS35基因CDS序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析;接著篩選出牛優(yōu)勢卵泡與從屬卵泡;對(duì)PRSS35蛋白在牛卵泡顆粒細(xì)胞中進(jìn)行定位,接著從基因與蛋白兩方面研究PRSS35對(duì)牛卵泡顆粒細(xì)胞的影響;最后通過基因沉默,siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞確定PRSS35基因在牛卵泡顆粒細(xì)胞生長發(fā)育中的作用,為探究PRSS35對(duì)牛卵泡發(fā)育過程中的作用奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果及結(jié)論如下:1.牛PRSS35基因CDS區(qū)序列全長1239 bp,編碼412個(gè)氨基酸。其蛋白PRSS35等電點(diǎn)9.82,堿性蛋白,分子量46.5KDa,是一種不穩(wěn)定親水性分泌蛋白,具有長度為20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽,11個(gè)O-糖基化位點(diǎn)、2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和3個(gè)磷酸化位點(diǎn),有一個(gè)典型Tryp_Spc結(jié)構(gòu)域,即胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析表明,牛與同為牛亞科水牛、以及�？凭d羊、山羊親緣關(guān)系最近,與嚙齒目大鼠和小鼠親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。2.對(duì)12頭牛卵巢最大卵泡與第二大卵泡卵泡液進(jìn)行ELISA激素測定,三頭牛最大卵泡E2濃度顯著高于第二大卵泡(P0.05),最大卵泡P4濃度顯著低于第二大卵泡(P0.05)。12頭牛共篩選出3頭牛的最大卵泡和第二大卵泡分別為牛優(yōu)勢卵泡和從屬卵泡。3.免疫組化分析表明,PRSS35在牛優(yōu)勢與從屬卵泡顆粒層均有表達(dá);熒光定量PCR結(jié)果顯示PRSS35mRNA在牛優(yōu)勢卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量極顯著高于從屬卵泡(P0.001);Western Blot結(jié)果顯示PRSS35蛋白在牛優(yōu)勢卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量極顯著高于從屬卵泡(P0.01)。4.基因沉默結(jié)果表明,沉默PRSS35基因會(huì)使卵泡顆粒細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)增多,卵泡液雌激素含量降低,說明PRSS35基因促進(jìn)牛卵泡顆粒細(xì)胞的增殖,對(duì)牛卵泡生長發(fā)育起促進(jìn)作用。
【學(xué)位單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S823
【文章目錄】：
摘要
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1. 牛發(fā)情周期內(nèi)卵泡的生長發(fā)育
        1.1 卵泡發(fā)育過程
        1.2 卵泡發(fā)育波
        1.3 卵泡的募集
        1.4 卵泡的選擇與偏差
        1.5 卵泡的優(yōu)勢化
        1.6 卵泡的成熟與排卵
    2. 顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡發(fā)育的影響
        2.1 卵泡顆粒細(xì)胞
        2.2 卵泡顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞協(xié)同作用
        2.3 顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的影響
        2.4 顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡發(fā)育的影響
    3. 絲氨酸蛋白酶35 （PRSS35）研究進(jìn)展
        3.1 蛋白酶
        3.2 絲氨酸蛋白酶
        3.3 絲氨酸蛋白酶共同特征
        3.4 PRSS35的發(fā)現(xiàn)
        3.5 PRSS35的功能
    4. 本研究的目的和意義
第二章 PRSS35基因CDS序列克隆及生物信息學(xué)分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集
            1.1.1 卵巢采集
            1.1.2 顆粒細(xì)胞分離
        1.2 試驗(yàn)儀器及試劑
            1.2.1 主要儀器
            1.2.2 主要試劑
            1.2.3 溶液的配置
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 引物設(shè)計(jì)
            1.3.2 顆粒細(xì)胞Total RNA的提取
            1.3.3 Total RNA濃度及純度檢測
            1.3.4 反轉(zhuǎn)錄RT-PCR
            1.3.5 PCR擴(kuò)增
            1.3.6 電泳檢測
            1.3.7 PCR產(chǎn)物純化
            1.3.8 牛PRSS35基因克隆測序
            1.3.9 PRSS35基因及蛋白序列生物信息學(xué)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 牛卵泡顆粒細(xì)胞Total RNA
        2.2 牛PRSS35基因測序
        2.3 牛PRSS35蛋白的生物信息學(xué)分析
            2.3.1 牛PRSS35蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測
            2.3.2 牛PRSS35蛋白信號(hào)肽預(yù)測
            2.3.3 牛PRSS35蛋白糖基化位點(diǎn)以及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測
            2.3.4 牛PRSS35蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測
            2.3.5 牛PRSS35序列相似性及聚類分析
    3 討論
    4 小結(jié)
第三章 牛優(yōu)勢卵泡與從屬卵泡的篩選
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集
            1.1.1 卵巢采集
        1.2 試驗(yàn)儀器及試劑耗材
            1.2.1 試驗(yàn)儀器
            1.2.2 試驗(yàn)試劑及耗材
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 采集卵泡液并分離顆粒細(xì)胞
            1.3.2 雌激素和孕酮的測定
                1.3.2.1 試劑的準(zhǔn)備
                1.3.2.2 檢測程序
                1.3.2.3 計(jì)算結(jié)果
    2 結(jié)果與分析
        2.1 卵泡液中雌激素和孕酮的測定
    3 討論
    4 小結(jié)
第四章 PRSS35在牛卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品處理
            1.1.1 卵巢采集
            1.1.2 牛卵泡組織固定
            1.1.3 液氮研磨組織
        1.2 試驗(yàn)儀器及試劑耗材
            1.2.1 主要儀器
            1.2.2 試驗(yàn)試劑及耗材
            1.2.3 溶液的配置
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 牛卵泡組織切片制作
            1.3.2 免疫組織化學(xué)
            1.3.3 顆粒細(xì)胞Total RNA的提取
            1.3.4 反轉(zhuǎn)錄RT-PCR
            1.3.5 PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增
            1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）反應(yīng)
            1.3.7 顆粒細(xì)胞Total Protein的提取
            1.3.8 Western Blot反應(yīng)
            1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果
        2.2 熒光定量引物PCR結(jié)果
        2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）擴(kuò)增曲線與熔解曲線
        2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）結(jié)果
        2.5 Western Blot結(jié)果
    3 討論
    4 小結(jié)
第五章 PRSS35在牛卵泡顆粒細(xì)胞中的功能研究
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 試驗(yàn)儀器及試劑
            1.2.1 主要儀器
            1.2.2 主要試劑
            1.2.3 溶液的配置
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 siRNA的設(shè)計(jì)與合成
            1.3.2 卵泡的分離
            1.3.3 卵泡顆粒細(xì)胞的分離
            1.3.4 卵泡顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)
            1.3.5 卵泡顆粒細(xì)胞的傳代與凍存
            1.3.6 siRNA轉(zhuǎn)染卵泡顆粒細(xì)胞
            1.3.7 顆粒細(xì)胞Total RNA的提取
            1.3.8 反轉(zhuǎn)錄RT-PCR
            1.3.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）反應(yīng)
2濃度測定 '>            1.3.10 siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后培養(yǎng)液E₂濃度測定
            1.3.11 細(xì)胞凋亡檢測
            1.3.12 數(shù)據(jù)處理與分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果
        2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）結(jié)果
2濃度檢測 '>        2.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中雌二醇E₂濃度檢測
        2.4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果
    3 討論
    4 小結(jié)
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
Abstract
附錄
致謝

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