【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛的主要疾病之一,對全世界的奶牛養(yǎng)殖業(yè)以及乳制品行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。引起奶牛乳房炎的病原除了常見的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌等以外,凝固酶陰性葡萄球菌引起的感染呈上升趨勢,已成為引起奶牛乳房炎發(fā)生病原的新特點。其中,木糖葡萄球菌在凝固酶陰性葡萄球菌引起的奶牛乳房炎病例中的分離率呈逐年上升趨勢,已成為主要的病原菌。奶牛感染后主要利用抗菌藥物進行治療,細菌長期處于藥物選擇壓力下,逐漸進化為對該藥物的耐藥菌,甚至進化成為對其他種類藥物的多重耐藥菌,這給建立臨床合理用藥方案帶來困難。因此,探究不同種類藥物之間交叉耐藥機制對于指導(dǎo)臨床合理用藥及抗菌藥物減量使用意義重大。泰樂菌素作為大環(huán)內(nèi)酯類藥物中一種,被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床中。其作用機制為阻止肽酰基tRNA從mRNA的“A”位移向“P”位,使氨�；鵷RNA不能結(jié)合到“A”位,從而抑制細菌蛋白質(zhì)合成。氟苯尼考作為酰胺醇類藥物中的一種畜禽專用藥物,也被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床中,是一種典型的肽基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,阻止tRNA結(jié)合到A位,通過抑制肽鍵形成,競爭性地阻止轉(zhuǎn)運狀態(tài),從而抑制肽基轉(zhuǎn)移酶的活性。以往研究表明,細菌在單一藥物選擇壓力下,會進化出對其他種類藥物的耐藥表型。但目前尚未見木糖葡萄球菌對泰樂菌素和氟苯尼考交叉耐藥機制的相關(guān)研究。故本研究擬通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),初步確定可能與交叉耐藥相關(guān)的蛋白;以體外誘導(dǎo)獲得的泰樂菌素耐藥木糖葡萄球菌為研究對象,利用實時熒光定量PCR探究上述耐藥相關(guān)蛋白在木糖葡萄球菌交叉耐藥機制中的作用,闡明其在進化過程中的表達規(guī)律,確定與交叉耐藥相關(guān)的耐藥蛋白;利用分子克隆、基因測序、同源模建、分子對接以及基因組定點突變的方法,闡明木糖葡萄球菌對泰樂菌素和氟苯尼考交叉耐藥的分子機制。具體研究結(jié)果如下:(1)木糖葡萄球菌對泰樂菌素和氯霉素類藥物可能存在交叉耐藥現(xiàn)象,推斷與“轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白”和“壓力應(yīng)激相關(guān)蛋白”有關(guān)。1/2 MIC(0.25μg/mL)泰樂菌素選擇壓力下,利用蛋白質(zhì)組學(xué)i TRAQ技術(shù),獲得木糖葡萄球菌的差異表達蛋白。根據(jù)差異表達蛋白選擇標(biāo)準,即ratio1.2 or0.8(p-value0.05),篩選并鑒定出155個差異表達蛋白。其中氯霉素耐藥蛋白上調(diào)1.69倍,提示泰樂菌素選擇壓力下,木糖葡萄球菌可能進化為對氯霉素類藥物耐藥菌。通過對差異表達蛋白進行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明差異表達蛋白主要聚類成與“轉(zhuǎn)錄相關(guān)”(核糖體蛋白L23(rplw)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子IF-2(infB)和“壓力應(yīng)激相關(guān)”(過氧化氫酶(Kat)、硫氧還蛋白(trxA)、醛脫氫酶(aldA-1)、伴侶蛋白(gros)和L-乳酸脫氫酶(ldh))的兩類蛋白。(2)泰樂菌素耐藥木糖葡萄球菌對氟苯尼考交叉耐藥。以泰樂菌素為誘導(dǎo)藥物,利用實驗室體外強誘導(dǎo)方式,獲得泰樂菌素耐藥木糖葡萄球菌,并考察其對氯霉素類藥物氟苯尼考的耐藥性,由0.5μg/mL升高至8μg/mL。(3)“轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白”、“壓力應(yīng)激相關(guān)蛋白”以及氯霉素耐藥蛋白可能在木糖葡萄球菌進化為對泰樂菌素和氟苯尼考交叉耐藥的過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。基于不同水平的泰樂菌素耐藥木糖葡萄球菌,利用實時定量熒光PCR技術(shù)測定“轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白”(核糖體蛋白L23(rplw)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子IF-2(infB))、“壓力應(yīng)激相關(guān)蛋白”(過氧化氫酶(Kat)、硫氧還蛋白(trxA)、醛脫氫酶(aldA-1)、伴侶蛋白(gros)和L-乳酸脫氫酶(ldh))以及氯霉素耐藥蛋白(cl)的表達水平,結(jié)果表明,隨著耐藥水平的升高,耐藥蛋白均發(fā)生規(guī)律性變化,其中核糖體蛋白L23上調(diào)表達2.8倍、硫氧還蛋白上調(diào)表達4.2倍、醛脫氫酶上調(diào)表達2.4倍、伴侶蛋白上調(diào)表達5.93倍和氯霉素耐藥蛋白上調(diào)1.5倍,L-乳酸脫氫酶下調(diào)2.5倍,而轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和過氧化氫酶表達并未發(fā)生差異性改變。(4)木糖葡萄球菌對泰樂菌素和氟苯尼考交叉耐藥可能與核糖體突變相關(guān),包括核糖體蛋白L3 N135G、A137G、S142A和R162K、L4 S158N和A164E、L22 97KRTSAIN98氨基酸插入以及23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C。利用基因克隆、DNA測序以及DNAMAN序列比對分析,初步確定可能與交叉耐藥相關(guān)的核糖體突變位點,利用PDB蛋白數(shù)據(jù)庫中與木糖葡萄球菌核糖體蛋白L3、L4和L22一級序列同源性較高的金黃色葡萄球菌氨基酸序列作為模板進行同源模建,并對構(gòu)建的蛋白進行優(yōu)化和評估。在此基礎(chǔ)上,利用CDOCKER方法,采用盲對接方式,將同源模建的核糖體蛋白與泰樂菌素和氟苯尼考分別進行分子對接,通過能量運算預(yù)測可能的結(jié)合位點。綜合以上兩部分結(jié)果確定可能與交叉耐藥相關(guān)的核糖體突變位點為核糖體蛋白L3 N135G、A137G、S142A和R162K,L4 S158N和A164E、L22 97KRTSAIN98氨基酸插入以及23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C。(5)通過構(gòu)建上述可能與交叉耐藥相關(guān)的核糖體突變菌株,說明核糖體蛋白L2297KRTSAIN98氨基酸插入、23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C突變是導(dǎo)致木糖葡萄球菌對泰樂菌素和氟苯尼考交叉耐藥機制之一。利用同源重組的方法,對木糖葡糖球菌基因組進行定點突變,同時引入綠熒光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)篩選標(biāo)簽,通過流式細胞儀篩選以及對突變片段DNA測序,最終獲得6株基因突變菌株即木糖葡萄球菌rplC基因突變菌株、木糖葡萄球菌rplD基因突變菌株、木糖葡萄球菌rplV基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA A2662C基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突變菌株和木糖葡萄球菌23S rRNA T2560C基因突變菌株。并對其耐藥表型進行考察,結(jié)果表明木糖葡萄球菌rplV基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA A2662C基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突變菌株和木糖葡萄球菌23S rRNA T2560C基因突變菌株對泰樂菌素的MIC由0.5μg/mL升高至128μg/mL,對氟苯尼考的MIC由0.5μg/mL升高至2μg/mL。(6)利用計算機分子模擬,構(gòu)建木糖葡萄球菌rRNA結(jié)構(gòu),將其與泰樂菌素和氟苯尼考分別進行分子對接,結(jié)果表明23S rRNA A2275是兩個藥物的交叉結(jié)合位點。通過探究交叉結(jié)合位點與突變位點的空間結(jié)構(gòu)關(guān)系,闡明上述試驗結(jié)果的可信性,即核糖體蛋白L2297KRTSAIN98氨基酸插入、23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C突變與交叉耐藥分子機制有關(guān)。利用與木糖葡萄球菌同源性較高的金黃色葡萄球菌23S rRNA結(jié)構(gòu),通過DS 3.0中蛋白疊合模塊,構(gòu)建木糖葡萄球菌rRNA結(jié)構(gòu),包括23S rRNA和核糖體蛋白L3、L4和L22。進而利用SYBYL對接程序?qū)?gòu)建rRNA與泰樂菌素和氟苯尼考分別進行分子對接,綜合Crash和Polar打分情況確定泰樂菌素與23S rRNA結(jié)構(gòu)中的核苷酸A2275、C2276、G2281、U2466和C2470形成了較強的氫鍵,氟苯尼考與23S rRNA結(jié)構(gòu)中的核苷酸A2275和G2095形成氫鍵,它們共同的結(jié)合位點是A2275。(7)核糖體蛋白L22 97KRTSAIN98氨基酸插入和23S rRNA C1305A與T2560C核苷酸突變調(diào)節(jié)耐藥蛋白表達是導(dǎo)致木糖葡萄球菌對泰樂菌素和氟苯尼考交叉耐藥機制之一。以木糖葡萄球菌rplV基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA A2662C基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突變菌株以及木糖葡萄球菌23S rRNA T2560C基因突變菌株為研究對象,考察耐藥蛋白(核糖體蛋白L23、硫氧還蛋白、醛脫氫酶、伴侶蛋白和氯霉素耐藥蛋白)轉(zhuǎn)錄表達水平,結(jié)果表明木糖葡萄球菌rplV基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突變菌株以及木糖23S rRNA T2560C基因突變菌株中耐藥蛋白的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生差異性表達。然而,木糖23S rRNA A2662C基因突變菌株中耐藥蛋白的轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生差異性表達。綜上所述,木糖葡萄球菌對泰樂菌素和氟苯尼考交叉耐藥受多個機制調(diào)控,不僅與核糖體蛋白L22 97KRTSAIN98氨基酸插入和23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C突變有關(guān),還與“轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白”即核糖體蛋白L23、“壓力應(yīng)激相關(guān)蛋白”即硫氧還蛋白、醛脫氫酶、伴侶蛋白以及氯霉素耐藥蛋白的差異表達有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S859.7
【圖文】：

抗菌藥物研發(fā)以及耐藥性發(fā)生時間軸（軸上方為抗菌藥物研發(fā)的時間為耐藥性產(chǎn)生的時間）[34]re 1-1 The timeline of antibiotic deployment (above) and the antibiotic resiobserved (below)[34]耐藥性已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點界衛(wèi)生組織（WHO）針對耐藥性問題發(fā)布一份報告即《抗微生物藥物測報告》，其中表明抗微生物藥物耐藥性現(xiàn)象是普遍存在的，不分國籍此，細菌耐藥性的問題已經(jīng)是一個全球性問題。許多國家和國際組織的回應(yīng)并采取積極的措施。2016年9月，聯(lián)合國193個成員國簽署了一作掃除“超級病菌”對人類健康的威脅[40]。許多發(fā)達國家如美國、日本續(xù)建立細菌耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)，我國在2005年也展開行動[41]，包括獸用動物源細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)。同時也在2016年8月印發(fā)了遏制細菌耐藥國20年）行動的通知。源性細菌耐藥性已成為公共安全問題

技術(shù)路線

將其作為下一代誘導(dǎo)的母菌，重復(fù)以上步驟，見圖2-1。對每一代誘導(dǎo)菌進行菌株的 PCR 鑒定和 MIC 測定，同時對其進行-80 保℃存。此外，為了考察上述獲得耐藥菌株的穩(wěn)定性，利用無泰樂菌素的 TSB 培養(yǎng)基對耐藥突變菌進行連續(xù)傳10 代，依次取 0 代、2 代、4 代、6 代、8 代和 10 代的菌株進行 MIC 測定。20
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本文編號：2883116