新霉素(Neomycin,NEO)屬于氨基糖苷類藥物。主要用來治療畜禽耳炎、皮炎等感染,雞白痢等疫病,還可以預防動物性疾病,并促進動物的生長發(fā)育,因價格低廉、效果明顯而在畜牧業(yè)中得到了廣泛應用。但長期使用,或超劑量用藥,能在動物組織中沉積、殘留,不僅會對動物健康造成危害,還會通過食物鏈危害消費者的健康。其危害性主要包括耳毒性、腎毒性以及神經肌肉阻滯現(xiàn)象等。新霉素殘留現(xiàn)有的檢測方法有微生物檢測方法、色譜檢測方法、免疫學檢測方法等。在眾多檢測方法中,微生物法可通過半定量篩選實驗對食物中的獸藥殘留進行分析,但無法定量;薄層色譜法可分離多種物質、成本低,但其結果易受主觀因素影響;高效液相色譜能夠為藥代動力學研究和其它調查研究提供所需的檢測特異性和靈敏度,但需要昂貴的儀器設備和熟練的操作人員;快速的酶聯(lián)免疫在精確測定復雜體系中的新霉素的含量時非常有用,但操作過程中需要反復洗滌及孵育,影響了檢測時間和效率。因此,構建新霉素簡單、快速、特異的檢測方法是一個熱門研究方向。本論文擬通過新霉素人工抗原及單克隆抗體制備,結合熒光偏振技術,建立新霉素的熒光偏振免疫學檢測方法。本文主要包含以下幾個部分:1.新霉素人工抗原的合成與鑒定分析新霉素化學結構,針對新霉素化學結構中的氨基活性基團,選取牛血清蛋白(BSA)和雞卵清蛋白(OVA)作為載體蛋白,采用戊二醛法制備人工免疫原NEO-BSA和NEO-OVA。通過紫外掃描、SDS-PAGE電泳進行初步鑒定,動物免疫對人工抗原進行進一步鑒定。紫外掃描結果顯示,偶聯(lián)產物與載體蛋白的吸收峰沒有重疊;SDS-PAGE電泳結果顯示,載體蛋白的遷移速率比偶聯(lián)產物快,由兩個實驗初步判定人工抗原偶聯(lián)成功;NEO-BSA所免疫小鼠的多抗血清效價都在1:6400以上,半數(shù)抑制濃度(IC50)為27.35ng/m L,表明偶聯(lián)的人工抗原具有良好的免疫原性,且能誘導動物機體產生針對新霉素的特異性抗體。2.新霉素單克隆抗體的制備及鑒定取NEO-BSA免疫的小鼠中血清效價及靈敏度最高的小鼠的脾細胞,通過細胞融合技術將其與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合,采用間接酶聯(lián)免疫法對雜交瘤細胞進行篩選和亞克隆等一系列篩選實驗,篩選出3株能分泌抗新霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為1E9、4E8、1G1,經測定細胞上清效價均在1:6.4×103以上,選取效價較高的1E9雜交瘤細胞株用體內誘生腹水法制備腹水。將得到的單抗進行純化,并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行鑒定,判定純化成功。通過間接競爭ELISA測抑制,得到線性回歸方程為y=-0.7398x+2.813的標準曲線,相關系數(shù)R2=0.9948,根據線性回歸方程可得IC50=1.338ng/m L。通過間接競爭ELISA對其特異性進行檢測,與其它氨基糖苷類藥物交叉反應率均低于0.01%,發(fā)現(xiàn)與其他藥物均無交叉。經以上試驗驗證,成功制備了特異性高、靈敏度強的新霉素單克隆抗體,為熒光偏振檢測方法提供了所需抗體。3.新霉素熒光偏振檢測方法的建立將新霉素與熒光物質異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián),獲得示蹤物,采用TLC進行分離純化,分別經甲醇及碳酸鹽緩沖液(CBS)萃取后,篩選出與抗體結合能力最佳的分離條帶,即Rf=0.4由CBS萃取得到的物質。優(yōu)化示蹤物及抗體的工作濃度,對反應體系進行優(yōu)化,建立標準曲線,得到線性回歸方程Y=128.9+53.2/[(1+56.5/x)-1.175],由方程可得IC50為56.5ng/mL,線性范圍為17.37ng/mL-183.92ng/mL,相關系數(shù)R2=0.9930。4.熒光偏振檢測方法在檢測牛奶中新霉素殘留的應用對牛奶的處理方法進行優(yōu)化,確定對牛奶先進行稀釋,后采用飽和硫酸銨法沉淀處理牛奶。向牛奶中添加新霉素標品,配置成濃度為30ng/mL、50ng/mL、70ng/m L的新霉素牛奶溶液,對添加過標品的牛奶進行處理后,應用已建立的熒光偏振檢測方法進行檢測,回收率為87.91%-114.28%。
【學位單位】：河南科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S859.84;O657.3
【部分圖文】：

圖 1-1 熒光偏振檢測原理圖Fig. 1-1 The schematic diagram of FPIA.7 本研究的目的和意義隨著研究的深入，人們逐漸認識到了氨基糖苷類抗生素的兩面性，不合理會產生藥物殘留，進而對人類健康造成危害，所以應嚴格按照其限量進行，并注意休藥期。然而現(xiàn)實生活中，在利益的驅使下，超限量使用的情況仍在，這就要求相關監(jiān)管部門加大對抗生素類藥物殘留的監(jiān)測力度。所以為了監(jiān)管部門進對食品中新霉素殘留進行快速精準監(jiān)測，確保食品安全性，為廣費者提供健康保障，建立完善的快速高效靈敏的新霉素的檢測技術已刻不。在眾多檢測方法中，微生物法可通過半定量篩選實驗對食物中的獸藥殘留分析，但無法定量；薄層色譜法可分離多種物質、成本低，但其結果易受主素影響；高效液相色譜在藥代動力學研究和其它調查研究中提供所需要的特和靈敏度，但需要昂貴的儀器設備和熟練的操作人員；快速的酶聯(lián)免疫在精

算其抑制率 B/B0（B0：新霉素濃度為 0 時的 OD450，B：新霉素其50），以 B/B0的結果為縱坐標，以新霉素質量濃度（ng/mL）的對，繪制新霉素對小鼠多抗血清的抑制曲線，根據繪制的標準曲線推，計算多抗血清對新霉素 50%的抑制濃度（IC50），以其來衡量多度。結果與分析新霉素人工抗原的鑒定結果1）紫外掃描鑒定結果用 U-3000 紫外掃描儀對 BSA、NEO-BSA、OVA、NEO-OVA 進 波長掃描。由圖 2-1、圖 2-2 可以看出 BSA、OVA 特征吸收峰在 物 NEO-BSA、NEO-OVA 在 268nm 處出現(xiàn)最大吸收峰，與 BSA 最移，初步證明偶聯(lián)成功。

圖 2-2 OVA、NEO-OVA 紫外掃描光譜Fig. 2-2 The UV scanning spectrum of OVA、NEO-OVASDS-PAGE 凝膠電泳鑒定 2-3 可知，NEO-BSA 的泳動速度小于 BSA，而且有較明顯 BSA 的分子量小于 NEO-BSA，初步證明 NEO 與 BSA 偶聯(lián)
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本文編號：2878965