【摘要】：犬瘟熱(CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種在食肉目動物中廣泛傳播的急性,高傳染性疾病,具有較高的發(fā)病率和死亡率。CDV野毒株很難在無受體的細(xì)胞系上進(jìn)行傳代,嚴(yán)重制約CDV的深入研究。本研究旨在構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)SLAM受體的SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系,比較其對CDV野毒株的敏感性,并對分離到的CDV野毒株進(jìn)行全基因組測序、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。本研究從以下幾個方面開展:Ⅰ SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系建立本將真核表達(dá)載體Pcag-SLAM分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞。經(jīng)G418壓力篩選結(jié)合有限稀釋法篩選陽性克隆株,并通過RT-PCR、間接免疫熒光鑒定(IFA)和western blot等方法對穩(wěn)定表達(dá)SLAM受體的SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系加以驗證。結(jié)果顯示本試驗成功構(gòu)建出SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系。Ⅱ CDV的分離及鑒定本研究探索了SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系對CDV的分離率,比較不同組織對同種細(xì)胞系的趨向性,對分離得到的CDV進(jìn)行RT-PCR、IFA鑒定、電鏡觀察、動物回歸實驗。結(jié)果顯示利用SLAM-Vero細(xì)胞從3只CDV陽性犬的肺和脾中分離得到2株CDV,而SLAM-BHK21細(xì)胞系,親本Vero細(xì)胞及親本BHK21細(xì)胞未能分離出病毒。Ⅲ CDV全基因組序列測序及系統(tǒng)發(fā)生分析對分離得到的CDV-SC1706株進(jìn)行全基因組測序和系統(tǒng)發(fā)生分析,結(jié)果表明其核苷酸全長15690 bp。SC1706分離株的N基因系統(tǒng)分析顯示該毒株與分離自遼寧的LN(10)1的同源性最高,達(dá)到99.6%,都屬于亞洲1型野毒株。SC1706株與大熊貓分離株SX2014和Louguantai 1的同源性也分別達(dá)到了98.4%和98.3%,顯示它們之間有很近的親緣關(guān)系。與經(jīng)典的onderstepoort疫苗株和shuskiy疫苗株的同源性很低,分別是有93.5%和93.1%。與CDV 3疫苗株的同源性最低,只有93%。SC1706株有9個潛在的N-糖基化位點,這一特點是野毒株特有的。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

a：具有脂質(zhì)蛋白囊膜（黑色圓圈）的 CDV 示意圖b：CDV 基因組結(jié)構(gòu)模式圖。圖 1.1 在脂蛋白下面是病毒基質(zhì)蛋白(深粉紅色)，插入病毒囊膜的分別是血凝素蛋白(H)(黃色)和融合蛋白(F)(綠色)；大蛋白（L）（紫色）、核衣殼蛋白（N）（藍(lán)色）和磷蛋白（P）（深紫色）這三個蛋白一起形成核糖核酸蛋白復(fù)合物（RNP）。該示意圖沒有說明蛋白質(zhì)的相對豐度和比例。參考自 Sato 等人[26]。Fig. 1.1 Schematic diagram of a (a) CDV with a lipoprotein envelope (black circle), containing anon-segmented negative-sense ssRNAgenome, consisting of six genes (b). Adapted from Sato etal[26].

這兩種受體都存在一種類似免疫蛋白的一個結(jié)合面[78]。SLAM 作為免疫細(xì)胞受體[79]樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面[78, 80]。第二種細(xì)胞受 CDV 的上皮細(xì)胞受體[77, 82]，Nectin-4 參與細(xì)和內(nèi)皮組織的連接[83]。Nectin-4 被認(rèn)為是一種細(xì)胞釋放后，在感染的后期發(fā)揮作用[82]。M（CD150）激活分子(Signaling lymphocyte activation mol胞膜上的有八個潛在糖基化位點的一種糖蛋麻疹病毒屬病毒的主要受體[85]，影響 CDV 的性[86]。SLAM 是有選擇的表達(dá)在免疫細(xì)胞，形病毒共同的受體[88]（結(jié)構(gòu)如圖 1.2）。

的殘基之間相似性很高，表明了這組動，將貓科和犬科動物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了幾科動物 SLAM 受體的電荷差異[94]。因此不太適應(yīng)與另一個非犬的 SLAM 受體結(jié) 受體犬身上發(fā)現(xiàn)了一個新的上皮細(xì)胞受體 ne的 6-9 d，病毒通過上皮細(xì)胞受體 Nect內(nèi)分泌系統(tǒng)的上皮細(xì)胞[82, 97]。當(dāng)宿主免統(tǒng)，使宿主產(chǎn)生神經(jīng)癥狀[98]。Nectin-4 ，其他未知的受體也可能參與其中[99]。異體，這兩種變體對病毒侵入及病毒在細(xì)
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本文編號：2870927