發(fā)布時間：2020-10-27 22:10

　　 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎最為常見的兩種細菌,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和磷脂壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)分別是大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的主要毒力成分,均能引起奶牛乳腺內(nèi)的炎癥反應(yīng)。在健康奶牛的乳腺結(jié)構(gòu)中,腺泡上皮細胞之間的緊密連接參與構(gòu)成血乳屏障,防止牛奶成分通過乳腺腺泡與血清相互滲透。細菌引起的乳腺炎誘發(fā)血乳屏障發(fā)生損傷時,常伴隨著奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epitheiali cells,BMECs)緊密連接的變化。本研究旨在通過RNA-seq分析分別用LPS和LTA侵染奶牛BMECs引起的轉(zhuǎn)錄組表達變化,并探究在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎血乳屏障損傷中差異表達的促炎性因子發(fā)揮的作用。實驗首先用LPS或LTA侵染奶牛乳腺上皮細胞建立體外的乳腺炎細胞模型,通過高通量測序RNA-Seq分析,篩選奶牛BMECs對這兩種不同的毒力因子的差異表達mRNA。通過對差異表達基因進行分析確定在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎期間能夠引起乳腺炎血乳屏障損傷的促炎因子。在這些差異表達基因中,LPS處理組中白介素1β(IL-1β)表達顯著增高并且多個炎癥相關(guān)的信號通路均富集了IL-1β,隨后實驗深入研究IL-1β在乳腺炎血乳屏障損傷過程中發(fā)揮的作用。實驗進一步用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)驗證IL-1β等促炎性因子的mRNA表達水平是否與測序結(jié)果相一致,并分別在患有乳腺炎和正常的乳腺組織中用qRT-PCR及酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測IL-1β在mRNA和蛋白水平上的表達和分泌水平,驗證了IL-1β確實參與乳腺的炎癥反應(yīng)過程。隨后,實驗用外源性IL-1β處理BMECs來模擬炎癥狀態(tài)下增高的IL-1β對乳腺上皮細胞細胞緊密連接通透性的影響及作用機制。實驗在細胞水平上用蛋白印跡(Western Blotting)和免疫熒光檢測三種緊密連接蛋白ZO-1,occludin和claudin-1的表達,發(fā)現(xiàn)在IL-1β處理組的表達明顯降低。通過跨上皮細胞電阻檢測、中性粒細胞遷移實驗和異硫氰酸熒光素FITC葡聚糖透過性實驗檢測等發(fā)現(xiàn)IL-1β處理可明顯增強BMECs緊密連接通透性。在組織水平上,HE染色、免疫熒光和電鏡觀察上皮細胞超微結(jié)構(gòu)等發(fā)現(xiàn)IL-1β處理過的小鼠乳腺組織血乳屏障破壞,為探究該過程是否被肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)調(diào)節(jié),用MLCK抑制劑ML-7預(yù)處理BMECs依次進行上述實驗,發(fā)現(xiàn)ML-7預(yù)處理過的BMECs緊密連接恢復正常。實驗進一步通過ERK1/2抑制劑處理上皮細胞,通過Western Blotting和qRT-PCR檢測MLCK在蛋白和mRNA水平上的表達,發(fā)現(xiàn)IL-1β引起B(yǎng)MECs緊密連接的變化是通過IL-1β-ERK1/2-MLCK信號通路引起的。上述結(jié)果表明LPS和LTA能夠引起B(yǎng)MECs發(fā)生全基因組表達變化,IL-1β能夠通過IL-1β-ERK1/2-MLCK信號通路對BMECs緊密連接及血乳屏障產(chǎn)生影響,這一結(jié)果為奶牛乳腺炎血乳屏障損傷的發(fā)生和奶牛乳腺炎的防治提供新的思路。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S858.23
【部分圖文】：

LTA1、 2、3 和 LPS1、 2、3 分別代表正常對照組、LTA 處理組和 LPS 處理組的三個生物學重復。Fig 2-1. Clustering analysis of DEGs（A）LPS vs Control（.B）LTAvs Control（.C）LPS vs LTA. The red color represents the up-regulatedexpression of genes, while the green color represents down-regulated expression of genes. Gradient colorbarcode at the right top indicates log2(FPKM) value. Each row represents a gene and each columnrepresents a sample. Genes with similar expression value are clustered both at row and column level.Control 1, 2 and 3, LPS1, 2, and 3, LTA1, 2, and 3 mean three different biological repeats for each group.在熱圖中，LPS 處理組和 LTA 處理組和對照組相比有 10 個基因發(fā)生差異表達。其中兩個差異表達基因LOC100297121 和LOC788523在LPS和LTA處理組均上調(diào)表達，沒有共同下調(diào)表達的基因。另外，與對照組相比，其中有 8 個基因 CCL2, CCL20, CXCL2,CXCL3, CXCL5, CXCL6, IL-1β, 和 IFIT2 在 LPS 處理組中上調(diào)表達而在 LTA 處理組下調(diào)表達（圖 2-2），這 8 個基因均為趨化因子或細胞因子。

圖 2-3 KEGG 富集分析散點圖ich factor 是在這一途徑項中標注的不同表達的基因數(shù)與在此路徑中標注的所有基因數(shù)的比意味著更強的強度。Q-value 代表優(yōu)化的 p 值，越小代表越集中富集。 符號代表在三個處組中均有富集。Fig 2-3 Scatter plots for KEGG enrichment results.he Rich factor is the ratio of differentially expressed gene numbers annotated in this pathway terme number annotated in this pathway term. Greater rich factor means greater intensiveness. Q-valucted p value ranging from 0 to 1, and less Q-value means greater intensiveness. The symbol of indicates the enriched pathways shared with three pairs.18

（3）用熒光酶標儀分別在 493nm 激發(fā)光和 518nm 發(fā)射光下測定 FITC-葡聚糖不同梯度濃度的熒光強度，每個濃度測定 3 次，取 3 次測量的平均值，繪制 FITC-葡聚糖濃度與熒光強度標準曲線。（4）根據(jù)標準曲線計算不同透過時間下熒光強度，將 30min 下的未處理組設(shè)定為對照組，結(jié)果以各組與對照組的倍數(shù)顯示。3.3.13 數(shù)據(jù)分析本章所涉及實驗均重復 3 次，按照統(tǒng)計分析軟件 SPSS 13.0 的單因素 ANOVA 和LSD 檢驗進行，結(jié)果以平均值±標準差（mean±SD）的格式呈現(xiàn)。并利用雙尾 T 檢驗檢測各組之間差異的顯著性，*P<0.05 表示差異顯著；**P<0.01 表示差異極顯著。3.4 結(jié)果3.4.1.LPS 處理 BMECs 差異表達基因的驗證為了驗證測序結(jié)果，我們隨機挑選了 20 個差異表達基因并用定量實時 PCR 驗證它們的 mRNA 表達水平并與測序結(jié)果一致。（圖 3-1）
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本文編號：2859130