鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的家鴨、鵝、火雞和多種禽類的一種細(xì)菌性傳染病,臨床剖檢癥狀主要為全身漿膜的炎性滲出。本病在世界廣泛分布,感染引起高發(fā)病率和死亡率,為我國法定的二類動物疫病。RA血清型眾多且復(fù)雜,各血清型之間交叉保護(hù)性低,給該病的防治帶來諸多困難。而且本病一旦發(fā)生很難徹底清除,主要以藥物防治為主。因此加強(qiáng)RA的致病機(jī)制的研究,對從根本上預(yù)防該病的發(fā)生具有重要意義。鐵是細(xì)菌生長和繁殖的關(guān)鍵性元素,廣泛存在于細(xì)菌代謝途徑中。但是過量的鐵容易引起芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基進(jìn)而對細(xì)胞產(chǎn)生毒害反應(yīng)。鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白(ferric uptake regulator,Fur)不僅調(diào)控細(xì)菌鐵的穩(wěn)態(tài),并且能夠與其它調(diào)控系統(tǒng)協(xié)同作用,直接或間接調(diào)控細(xì)菌的生長、代謝和毒力。但是Fur在RA中的作用尚不清楚�；蛉笔羌�(xì)菌分子生物學(xué)研究的基本工具,但目前還沒有關(guān)于RA無抗性基因缺失株方法的報道。因此,本研究首先利用苯丙氨酸-t RNA合成酶phe S和lac Z,構(gòu)建了RA-YM株fur基因無抗性缺失突變株。以野生型質(zhì)粒p RA-JX為基礎(chǔ),構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc,利用該質(zhì)粒構(gòu)建回復(fù)株CΔfur。通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Fur與RA的毒力有關(guān)。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),篩選了鴨疫里氏桿菌基因組中受鐵調(diào)控基因和受Fur調(diào)控基因,對Fur調(diào)節(jié)RA的毒力機(jī)制進(jìn)行研究。具體內(nèi)容如下:1.鴨疫里氏桿菌fur基因無抗性基因缺失突變株Δfur及回復(fù)株CΔfur的構(gòu)建與鑒定本文首先構(gòu)建了用于RA無抗性基因缺失突變株的自殺性質(zhì)粒p RE-lac Z-mphe S-spc和回復(fù)株的穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc。利用生長抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RA對0.2%對氯苯丙氨酸敏感,證實(shí)phe S可以做為負(fù)篩選標(biāo)記。通過對Phe S 301位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楦拾彼?其它進(jìn)行無義突變,野生型核苷酸序列與突變型核苷酸序列同源性71%,減少在該位點(diǎn)發(fā)生同源重組的概率。將突變型phe S與RA的rps L基因啟動子融合構(gòu)建mphe S表達(dá)盒�？寺ac Z基因,與rps L啟動子融合,利用X-gal通過顏色可以直觀的鑒定同源重組是否完成。以p RE112質(zhì)粒為基礎(chǔ),結(jié)合抗性基因spc,負(fù)篩選標(biāo)記phe S和指示標(biāo)記lac Z連接構(gòu)建自殺性質(zhì)粒p RE-lac Z-mphe S-spc�？寺 RA-JX質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)域,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc,利用該質(zhì)�？梢詷�(gòu)建穩(wěn)定遺傳的回復(fù)突變菌株。構(gòu)建了RA-YMΔfur無抗性基因缺失突變株和回復(fù)株CΔfur�？寺ur基因的左、右同源臂,利用重疊PCR將左右同源臂融合,通過酶切的方法并連接至自殺性質(zhì)粒p RE-lac Z-mphe S-spc。以含有自殺性質(zhì)粒p RE-lac Z-mphe S-spc-fur的E.coli X7213為供體菌,以RA-YM株為受體菌,通過兩步同源重組法篩選得到RA-YMΔfur無抗性基因缺失突變株。第一步首先利用篩選標(biāo)記spc篩選雜合體菌株,第二步利用篩選標(biāo)記phe S和lac Z篩選無抗性基因缺失株�？寺ur基因啟動子和編碼區(qū)序列,利用重疊PCR融合fur基因啟動子和編碼區(qū),通過酶切的方法連接到穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc。以含有重組穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc-fur的E.coli X7213為供體菌,以RA-YMΔfur為受體菌,利用篩選標(biāo)記spc篩選回復(fù)株CΔfur。通過感染雛鴨測定RA-YMΔfur的致病性。動物試驗(yàn)結(jié)果顯示野生株RA-YM、基因缺失突變株RA-YMΔfur和回復(fù)突株CΔfur的LD50分別為2.0×106 CFU,1.6×108CFU和1.2×107 CFU。RA-YMΔfur基因缺失突變株的毒力較野生株RA-YM毒力下降約80倍,回復(fù)株CΔfur的毒力較RA-YMΔfur毒力有所回升。對野生株RA-YM和RA-YMΔfur基因缺失突變株的血液和組織載菌量進(jìn)行比較,結(jié)果顯示RA-YMΔfur基因缺失突變株的載菌量均較野生株RA-YM低。另外組織剖檢和病理切片觀察,RA-YMΔfur基因缺失突變株引起的組織病變較野生株RA-YM輕微。證實(shí)fur基因與RA-YM株的毒力有關(guān)。2.轉(zhuǎn)錄因子Fur的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的研究通過對RA-YM菌株和RA-YMΔfur菌株在限鐵和富鐵情況下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較,從全基因組水平上篩選受鐵調(diào)控基因和受Fur調(diào)控基因。并隨機(jī)挑選4個受鐵調(diào)控的基因和4個受Fur調(diào)控的基因,利用熒光定量PCR對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相符。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選出70個受鐵調(diào)控基因和17個受Fur調(diào)控基因。轉(zhuǎn)錄組測序具體結(jié)果如下:限鐵條件下,鐵調(diào)控的基因中有45個基因表達(dá)上調(diào)。其中7個與細(xì)菌的鐵運(yùn)輸和儲存有關(guān),6個與細(xì)菌的固氮過程有關(guān),5個與氨基酸和輔酶的合成有關(guān),5個與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)與修飾有關(guān),2個與嘌呤和核苷酸的合成有關(guān);其余的與大分子的合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能以及未知功能等有關(guān)。限鐵條件下,鐵調(diào)控的基因中有25個基因表達(dá)下調(diào)。其中6個與三羧酸循環(huán)有關(guān),7個與氧化應(yīng)激有關(guān),其余與細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及未知功能等有關(guān)。Fur直接調(diào)控的基因有17個,其中5個參與鐵的獲取,2個參與氧化應(yīng)激,1個為IX型分泌系統(tǒng)元件,其余參與氨基酸的合成和未知功能等。另外對Fur直接調(diào)控的基因啟動子序列分析,預(yù)測得到Fur結(jié)合位點(diǎn)的序列為5’-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3’。利用p ET28a-fur質(zhì)粒對Fur蛋白進(jìn)行原核表達(dá)。擴(kuò)增fur基因的編碼區(qū),通過酶切構(gòu)建p ET28a-fur質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化E.coil BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并利用His標(biāo)簽純化柱純化Fur蛋白。隨機(jī)選擇4個受Fur調(diào)控的基因,利用生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增其啟動子序列,利用原核表達(dá)的Fur蛋白,通過凝膠遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Fur蛋白與啟動子的互作,結(jié)果顯示Fur蛋白在體外可以與調(diào)控基因的啟動子序列結(jié)合。綜上所述,本試驗(yàn)成功的構(gòu)建了基于苯丙氨酸-t RNA合成酶phe S和lac Z為篩選標(biāo)記的無抗性基因缺失株方法,構(gòu)建了fur基因缺失株RA-YMΔfur。構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒p RES-JX-spc,利用該質(zhì)粒構(gòu)建了回復(fù)株CΔfur。通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證fur基因與RA的毒力有關(guān)。并通過對RA-YM和RA-YMΔfur在限鐵和富鐵情況下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較,獲得受鐵調(diào)控基因以及Fur調(diào)控基因,預(yù)測得到RA的Fur-box序列為5’-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3’。Fur通過調(diào)節(jié)鐵攝取系統(tǒng)和氧化還原反應(yīng)以及IX型分泌系統(tǒng)等,進(jìn)而調(diào)節(jié)TCA循環(huán)相關(guān)酶類的表達(dá),芳香族氨基酸,嘌呤和核苷酸的合成,影響RA的毒力。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

r and Choudhry 2010)。但是另一方面，鐵過剩對細(xì)菌芬頓反應(yīng)(Escolar et al 1999)。鐵容易將電子傳遞自由基, 對細(xì)胞膜、DNA 和蛋白質(zhì)等產(chǎn)生破壞(The必須保持在需要的限度之內(nèi)。多種機(jī)制，使自身可以獲得足夠的鐵的同時并維持多種途徑攝取鐵，一種途徑是利用鐵載體運(yùn)輸鐵離微生物都能夠大量合成鐵載體�！拌F載體”最初來載體是一類具有高度專一性的鐵螯合劑，能夠高特成受環(huán)境中鐵濃度的影響(Stintzi et al 2000)。鄰苯二菌素等均可結(jié)合 Fe3+(Henderson et al 2009)。分泌溶解鐵，然后鐵載體與 Fe3+特異性結(jié)合，通過 Ton隙，并與周質(zhì)蛋白結(jié)合傳遞至 ABC 系統(tǒng)(ATP-bin胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中鐵載體與 Fe3+分離，F(xiàn)e3+被還原利用(K ster2001)。革蘭氏陰性菌利用鐵載體運(yùn)輸鐵

圖 1-2 Fur 蛋白的負(fù)調(diào)控機(jī)制(Carpenter et al 2009)Fig. 1-2 The mechanism of iron-bound Fur repression控機(jī)制深入，發(fā)現(xiàn) Fur 蛋白不僅有負(fù)調(diào)控機(jī)制，還存在一r 的調(diào)控模式還存在爭議。但 Ernst 等發(fā)現(xiàn)在幽門、呼吸、能量代謝、趨藥性、氧自由基的清除的al 2005a)。另外幽門螺桿菌中 prf，sodB 基因也受1; Ernst et al 2005b)。近年研究發(fā)現(xiàn)空腸彎曲桿菌Holems et al 2005)。的調(diào)控機(jī)制與 Fur 的負(fù)調(diào)控機(jī)制的不同之處是：負(fù)爭結(jié)合位點(diǎn)，apo-Fur 調(diào)控機(jī)制是通過與轉(zhuǎn)錄抑制胞內(nèi) Fe2+不足時，apo-Fur 會與調(diào)控基因啟動子的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄抑制子的結(jié)合，從而使 RNA 聚合酶可以與調(diào)控基因順利轉(zhuǎn)錄。但當(dāng)胞內(nèi) Fe2+充足時，F(xiàn)ur 蛋白與 F

圖 1-3 apo-Fur 的調(diào)控機(jī)制(Carpenter et al 2009)Fig. 1-3 The regulator mechanism of apo-Fur螺桿菌內(nèi)，F(xiàn)ur-Fe2+復(fù)合物還可以誘導(dǎo)一些基因 oorD 基因、固氮作用相關(guān)的 nifS 基因均推測受z et al 2006;Alamuri et al 2006)。體結(jié)合在調(diào)控基因啟動子上的核苷酸序列稱為內(nèi)發(fā)現(xiàn)，不同的細(xì)菌 Fur-box 序列并不完全相回文序列。ur-box 序列是一個大小為 19 bp 的核苷酸序列�；鶠檩S的反向重復(fù)序列，序列為 GATAATGAT是“GATAAT”的 2-3 次重復(fù)形成的序列，F(xiàn)ur 序列從而結(jié)合到目標(biāo) DNA 上(Sebastian et al 強(qiáng) Fur 的結(jié)合，這個模型可以解釋大多數(shù)的 F
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本文編號：2848409