發(fā)布時(shí)間：2020-10-18 17:36

　　 狂犬病(Rabies),又稱(chēng)“恐水癥”,是由狂犬病病毒屬(Lyssavirus genus)的病毒感染引起的人獸共患傳染病。目前所有病例中,因該病毒屬最典型成員——狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的狂犬病病例占比最大。雖然使用疫苗并遵循合理的免疫程序能夠有效預(yù)防狂犬病,但是目前仍然缺少狂犬病發(fā)病后的有效治療方法,一旦出現(xiàn)臨床癥狀,其死亡率幾乎為100%。我國(guó)是狂犬病的高發(fā)地區(qū),死亡人數(shù)居世界第二位。因此,迫切需要加強(qiáng)RABV致病機(jī)制研究,以便從病毒或宿主角度尋找有效的救治靶點(diǎn)。細(xì)胞自噬是發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞清除異源性、內(nèi)源性異物的重要生理過(guò)程。大量研究證明,許多病毒的致病機(jī)制與細(xì)胞自噬有關(guān)。例如,水皰性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞的先天性免疫應(yīng)答,可抑制VSV的感染;而A型流感病毒等存在干擾自噬的分子機(jī)制,抑制自噬的發(fā)生而利于病毒的感染。截至目前,有關(guān)RABV感染和細(xì)胞自噬的研究較少。RABV標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株(CVS-11株)能夠引起小鼠嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀,并最終導(dǎo)致被感染小鼠的死亡。本實(shí)驗(yàn)室前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明,RABV(CVS-11株)感染的小鼠腦組織中差異表達(dá)蛋白高度靶向細(xì)胞自噬通路,且宿主自噬相關(guān)因子Bax-interacting factor-1(Bif-1)蛋白的表達(dá)存在顯著差異。為此,本研究選取Bif-1蛋白為研究對(duì)象,采用過(guò)表達(dá)、基因沉默等分子生物學(xué)技術(shù),對(duì)Bif-1蛋白表達(dá)與RABV(CVS-11株)復(fù)制的相互關(guān)系以及Bif-1蛋白的表達(dá)在RABV誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬過(guò)程中的作用進(jìn)行了初步探索。第一章:RABV感染對(duì)不同宿主細(xì)胞Bif-1蛋白表達(dá)的影響。以RABV(CVS-11株)分別感染小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞(Mouse neuroblastoma cells,NA)和乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(Baby hamster kidney cells,BHK),每隔12h收取細(xì)胞總RNA及蛋白樣品,同時(shí)設(shè)立未經(jīng)病毒感染的正常細(xì)胞對(duì)照組。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)等方法檢測(cè)樣品中Bif-1mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,NA細(xì)胞感染RABV后Bif-1mRNA水平表達(dá)量升高,而B(niǎo)if-1蛋白質(zhì)水平表達(dá)量早期短暫升高后又降低;BHK細(xì)胞感染RABV后Bif-1 mRNA水平及蛋白質(zhì)水平表達(dá)量均降低。表明RABV感染對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和體細(xì)胞中Bif-1蛋白表達(dá)的影響存在差異。第二章:不同宿主細(xì)胞Bif-1基因沉默對(duì)RABV復(fù)制的影響。設(shè)計(jì)并篩選靶向沉默Bif-1基因的sh RNA質(zhì)粒。shRNA質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NA或BHK細(xì)胞24h后接種RABV,于感染后24h、48h收取細(xì)胞培養(yǎng)液上清及細(xì)胞總RNA樣品,同時(shí)設(shè)立表達(dá)無(wú)靶向性shRNA的細(xì)胞對(duì)照組。應(yīng)用RT-qPCR、TCID_(50)測(cè)定的方法檢測(cè)細(xì)胞中病毒基因組RNA及上清中子代病毒的產(chǎn)量。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,NA細(xì)胞Bif-1基因沉默有利于RABV復(fù)制;BHK細(xì)胞Bif-1基因沉默抑制RABV復(fù)制。表明神經(jīng)細(xì)胞和體細(xì)胞中Bif-1蛋白基因沉默對(duì)RABV復(fù)制的影響是不同的。第三章:不同宿主細(xì)胞Bif-1蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)RABV復(fù)制的影響。構(gòu)建鼠源Bif-1蛋白7種選擇性剪接異構(gòu)體真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染、接毒及樣品檢測(cè)方法同第二章。同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞對(duì)照組。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,NA細(xì)胞過(guò)表達(dá)Bif-1b、c、e亞型蛋白抑制RABV復(fù)制;BHK細(xì)胞過(guò)表達(dá)Bif-1a、b、c、e亞型蛋白均有利于RABV復(fù)制。表明神經(jīng)細(xì)胞和體細(xì)胞中Bif-1蛋白不同亞型過(guò)表達(dá)對(duì)RABV復(fù)制的影響是不同的。第四章:NA細(xì)胞Bif-1蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)RABV誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用電鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、WB等方法檢測(cè)RABV感染正常NA細(xì)胞或過(guò)表達(dá)Bif-1蛋白的NA細(xì)胞后自噬體生成,自噬關(guān)鍵蛋白LC3-II、SQSTM1的表達(dá),Bif-1與LC3細(xì)胞內(nèi)定位,細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白Act-casp-3、Annexin V的表達(dá)。結(jié)果顯示,RABV感染誘導(dǎo)NA細(xì)胞發(fā)生不完整自噬并伴隨細(xì)胞凋亡;RABV感染誘導(dǎo)Bif-1蛋白與LC3發(fā)生共定位;過(guò)表達(dá)Bif-1蛋白促進(jìn)了RABV感染后自噬底物的降解,且抵抗RABV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。綜上所述,本研究從宿主蛋白和病毒相互作用的角度分析了Bif-1蛋白表達(dá)與RABV復(fù)制之間的相互關(guān)系,并從細(xì)胞自噬以及細(xì)胞凋亡的角度對(duì)Bif-1蛋白在RABV誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬、凋亡中的作用進(jìn)行了探索,表明Bif-1c亞型具有抵抗RABV復(fù)制的作用,可能成為抗RABV藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S852.65
【文章目錄】：
中文摘要
abstract
引言
第一篇 文獻(xiàn)綜述
    第一章 狂犬病概述
        1.1 狂犬病的歷史與現(xiàn)狀
        1.2 狂犬病病原學(xué)
        1.3 狂犬病病毒致病機(jī)制研究
        1.4 狂犬病發(fā)病后臨床處治
    第二章 Bif-1蛋白概述
        2.1 Bif-1蛋白與內(nèi)吞蛋白家族
        2.2 Bif-1與細(xì)胞凋亡
        2.3 Bif-1與細(xì)胞自噬
第二篇 研究?jī)?nèi)容
    第一章 RABV感染對(duì)不同宿主細(xì)胞Bif-1蛋白表達(dá)的影響
        1.1 材料與方法
        1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1.3 討論
        1.4 小結(jié)
    第二章 不同宿主細(xì)胞Bif-1基因沉默對(duì)RABV復(fù)制的影響
        2.1 材料與方法
        2.2 結(jié)果
        2.3 討論
        2.4 小結(jié)
    第三章 不同宿主細(xì)胞Bif-1蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)RABV復(fù)制的影響
        3.1 材料與方法
        3.2 結(jié)果
        3.3 討論
        3.4 小結(jié)
    第四章 NA細(xì)胞Bif-1蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)RABV誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的影響
        4.1 材料與方法
        4.2 結(jié)果
        4.3 討論
        4.4 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
導(dǎo)師簡(jiǎn)介
作者簡(jiǎn)介及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝

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本文編號(hào)：2846597