口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus,FMDV)感染偶蹄動(dòng)物引起的一種高度接觸性傳染病,可感染牛、羊和豬等70多種動(dòng)物。FMDV主要通過呼吸道和消化道黏膜侵入機(jī)體,對動(dòng)物的健康、生長、動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的全球貿(mào)易造成了嚴(yán)重影響,目前仍無安全高效的疫苗用于本病的預(yù)防。肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要免疫細(xì)胞,主要分布于皮膚和粘膜中,與樹突狀細(xì)胞共同構(gòu)成抗感染的第一道防線,可通過其表面的模式識別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)識別細(xì)胞內(nèi)外病原及病原相關(guān)產(chǎn)物,作為效應(yīng)細(xì)胞以吞噬或非吞噬途徑殺死病原體,在抗感染過程中發(fā)揮重要作用,因此被稱為機(jī)體的“哨位細(xì)胞”。肥大細(xì)胞通過PRRs識別病原體,可引起脫顆粒釋放多種活性物質(zhì),改變血管通透性、啟動(dòng)炎癥反應(yīng),并調(diào)節(jié)其他細(xì)胞功能,但目前對肥大細(xì)胞在抗FMDV感染中的作用了解甚少。清道夫受體(scavenger receptor,SR)是巨噬細(xì)胞等表達(dá)的吞噬受體和PRRs,可識別多種病毒和細(xì)菌,引起巨噬細(xì)胞活化,分泌TNF-α、IL-6與IFN-γ等。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞可通過SR識別重組FMDV VP1-VP4,SR在樹突狀細(xì)胞提呈FMDV VP1-VP4抗原中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用,但對SR介導(dǎo)巨噬細(xì)胞抗FMDV的免疫應(yīng)答作用尚不清楚。本研究用口蹄疫病毒樣顆粒(FMDV virus-like particles,FMDV-VLPs)分別負(fù)載小鼠腹腔肥大細(xì)胞(peritoneal mast cells,pMCs)和脫顆粒抑制劑丹參酮ⅡA預(yù)處理的pMCs,以不做處理的pMCs為對照組,培養(yǎng)6 h收集各組pMCs及其上清液,分別作用于脾初始淋巴細(xì)胞,以單純脾初始淋巴細(xì)胞為對照組,同時(shí)每個(gè)組均設(shè)刀豆蛋白A處理的對照組,用CCK-8試劑盒檢測淋巴細(xì)胞增殖,并對各組pMCs進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色,觀察脫顆�，F(xiàn)象。結(jié)果顯示,負(fù)載FMDV-VLPs的pMCs組未脫顆粒的pMCs數(shù)量極顯著低于單純pMCs組(P0.01)和丹參酮ⅡA預(yù)處理組(P0.01),這說明FMDV-VLPs刺激pMCs可引起明顯的脫顆粒。負(fù)載FMDV-VLPs的pMCs上清液對脾總淋巴細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用。丹參酮ⅡA可抑制FMDV-VLPs誘導(dǎo)的pMCs脫顆粒,并降低pMCs上清液促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用,但FMDV-VLPs刺激pMCs后的上清液對脾T淋巴細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用,丹參酮ⅡA處理組pMCs的上清液使脾T淋巴細(xì)胞增殖進(jìn)一步降低。這表明,在肥大細(xì)胞不與淋巴細(xì)胞接觸和無抗原存在的條件下,FMDV-VLPs誘導(dǎo)的pMCs脫顆粒產(chǎn)物具有促進(jìn)脾初始淋巴細(xì)胞增殖的作用,而其分泌成分則對脾T淋巴細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用。用FMDV-VLPs分別負(fù)載小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(peritoneal macrophages,pMΦ)、以及紫草素和番瀉苷B同時(shí)預(yù)處理的pMΦ,以不做處理的pMΦ為對照組,培養(yǎng)6h收集各組上清液,分別作用于脾初始淋巴細(xì)胞,以單純脾初始淋巴細(xì)胞、FMDV-VLPs處理的脾初始淋巴細(xì)胞、負(fù)載FMDV-VLPs的pMΦ-脾初始淋巴細(xì)胞為對照組,同時(shí)每個(gè)組均設(shè)刀豆蛋白A預(yù)處理的對照組,用CCK-8試劑盒檢測淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示,FMDV-VLPs可直接促進(jìn)脾總淋巴細(xì)胞增殖(P0.01),但不能直接促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖;負(fù)載FMDV-VLPs的pMΦ可極顯著促進(jìn)脾總淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增殖(P0.01),而且FMDV-VLPs通過pMΦ的提呈作用促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖的作用強(qiáng)于其直接刺激脾淋巴細(xì)胞增殖的作用;但負(fù)載FMDV-VLPs的pMΦ上清液不能促進(jìn)脾總淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞增殖作用,而且單純pMΦ上清液也不能促進(jìn)脾總淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞增殖作用。這表明,B淋巴細(xì)胞可通過B細(xì)胞受體直接特異性識別FMDV-VLPs啟動(dòng)活化與增殖,而不需要抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)的加工和處理,同時(shí)B淋巴細(xì)胞的活化需要抗原信號與共刺激信號的同時(shí)存在。盡管FMDV-VLPs刺激可引起pMCs和pMΦ分泌多種蛋白質(zhì)分子(如G-CSF、IL-13、IL-15、IL-17、IL-17BR等),但與pMCs相比,負(fù)載FMDV-VLPs的pMΦ只有與淋巴細(xì)胞接觸才能將其激活。值得注意的是,可抑制TNF-αmRNA成熟的紫草素和可抑制SR的番瀉苷B預(yù)處理后負(fù)載FMDV-VLPs的pMΦ上清液對脾總淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞均發(fā)揮極顯著的抑制作用(P0.01),這表明巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和SR所介導(dǎo)的生物學(xué)作用對脾臟免疫應(yīng)答的建立具有促進(jìn)作用。用FMDV-VLPs分別負(fù)載單純pMΦ、以及NF-κB抑制劑漢黃芩素和SR抑制劑番瀉苷B預(yù)處理后的pMΦ,以分別負(fù)載OVA或重組FMDV蛋白VP1-VP4的pMΦ為對照組,同時(shí)以不做處理的pMΦ為空白組。培養(yǎng)4 h分別收集各組pMΦ,用染色質(zhì)免疫共沉淀法(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)檢測NF-κB與TNF-α啟動(dòng)子的結(jié)合活性。用兔抗小鼠NF-κB1 p105/p50抗體進(jìn)行ChIP,與無關(guān)抗原的兔IgG進(jìn)行ChIP比較,所捕獲的TNF-α啟動(dòng)子片段的%Input值差異極顯著,其中pMΦ組所捕獲的TNF-α啟動(dòng)子片段的%Input值升高3.28倍(P0.001),OVA組升高11.27倍(P0.001),VP1-VP4組升高14.54倍(P0.001),FMDV-VLPs組升高4.65倍(P0.001),抑制劑處理組升高3.53倍(P0.001)。而比較各組用兔抗小鼠NF-κB1p105/p50抗體沉淀的NF-κB水平發(fā)現(xiàn),單純pMΦ組極顯著低于OVA組(P0.001)和VP1-VP4組(P0.001),顯著低于FMDV-VLPs組(P0.05)。OVA組極顯著高于FMDV-VLPs組(P0.01)和抑制劑處理組(P0.001)。VP1-VP4組顯著高于FMDV-VLPs組(P0.05),極顯著高于抑制劑處理組(P0.001)。結(jié)果表明,兔抗小鼠NF-κB1 p105/p50抗體可與NF-κB-TNF-α啟動(dòng)子復(fù)合物特異性結(jié)合,FMDV-VLPs和FMDV VP1-VP4均能刺激NF-κB活化進(jìn)核并結(jié)合TNF-α啟動(dòng)子。VP1-VP4組NF-κB與TNF-α啟動(dòng)子的結(jié)合活性最高,其次是OVA和FMDV-VLPs。用VP1-VP4作為FMD疫苗抗原可能會加劇接種動(dòng)物注射部位的組織炎癥,而FMDV-VLPs可緩解接種動(dòng)物注射部位的組織炎癥。漢黃芩素通過抑制NF-κB與TNF-α啟動(dòng)子的結(jié)合活性降低TNF-α的表達(dá),可抑制疫苗注射部位的炎癥,減輕疫苗接種動(dòng)物的痛苦。以上結(jié)果表明,肥大細(xì)胞可識別FMDV-VLPs,且能被刺激活化引起明顯的脫顆粒。同時(shí),被FMDV-VLPs活化的pMCs分泌的顆粒成分可促進(jìn)脾總初始淋巴細(xì)胞增殖,而其分泌成分則抑制初始T淋巴細(xì)胞增殖。巨噬細(xì)胞也能識別FMDV-VLPs,并可通過抗原提呈作用啟動(dòng)淋巴細(xì)胞增殖,但需巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞直接接觸;巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和其表面的SR所介導(dǎo)的生物學(xué)作用對脾臟免疫應(yīng)答的建立具有促進(jìn)作用。FMDV-VLPs和FMDV VP1-VP4刺激均可顯著提高巨噬細(xì)胞NF-κB與TNF-α啟動(dòng)子的結(jié)合活性,但VP1-VP4刺激活化NF-κB與TNF-α啟動(dòng)子結(jié)合的作用強(qiáng)于FMDV-VLPs,這表明VP1-VP4刺激TNF-α產(chǎn)生的作用較強(qiáng),可能會引起注射部位的炎癥反應(yīng),而FMDV-VLPs較弱,不會引起炎癥反應(yīng),可減輕接種疫苗的痛苦。漢黃芩素可通過抑制NF-κB的結(jié)合活性降低TNF-α,緩解疫苗注射部位的炎癥,減輕疫苗接種動(dòng)物的痛苦,故可用作口蹄疫疫苗的佐劑成分。
【學(xué)位單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

口蹄疫（food-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（FMD virus, FMDV）感染豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物引起的一種高度接觸性傳染病。易感動(dòng)物主要包括豬、牛、綿羊、山羊、水牛、駱駝等 70 多種動(dòng)物，其中牛最為易感�；疾�(dòng)物的主要發(fā)病特點(diǎn)是發(fā)熱，并在口腔黏膜、舌面、鼻鏡、蹄部和乳房等部位發(fā)生水泡和潰爛。因其對全球畜牧業(yè)生產(chǎn)與食品安全造成重大的威脅，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列入 A 類動(dòng)物傳染病之首。盡管人類發(fā)現(xiàn) FMD 已經(jīng)有五百多年的歷史，但由于對機(jī)體抗 FMDV 感染的免疫學(xué)機(jī)制缺乏足夠的認(rèn)識，目前仍無理想的疫苗用于本病預(yù)防[1,2]。1.1.1 口蹄疫病毒病原學(xué)口蹄疫病毒屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，由長約為8500個(gè)核苷酸的單股正鏈RNA基因組和對稱正二十面體的衣殼蛋白組成，外表呈球形，無囊膜。FMDV的衣殼是由結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4構(gòu)成二十面體的對稱結(jié)構(gòu)（圖1）。四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的各一分子組成一個(gè)殼粒，每五個(gè)殼粒經(jīng)一個(gè)脲敏感結(jié)合區(qū)聚集在一起形成一個(gè)五聚體，十二個(gè)五聚體借助組氨酸聚合成病毒衣殼，這就決定了病毒在低于pH 7.0的環(huán)境中的不穩(wěn)定性[3,4]。

圖2 2007年至2014年期間FMDV在全球各地區(qū)的爆發(fā)情況Fig. 2 Occurrence of FMDV events between 2007 and 2014[25]1.1.3 口蹄疫疫苗研究進(jìn)展1937年Waidmann等首次制成了鋁膠甲醛滅活疫苗并用于臨床至今已經(jīng)82年，人類研制出了多種FMD疫苗，包括滅活疫苗、DNA疫苗、基因工程苗、合成肽疫苗等。目前預(yù)防口蹄疫的各類疫苗雖然可誘導(dǎo)高水平的中和抗體，在口蹄疫控制中起著至關(guān)重要的作用，但是也依然存在許多問題，包括疫苗抗原的不穩(wěn)定性，純化過程中抗原的喪失，免疫原性低，抗體維持不足以及抗原保護(hù)范圍窄等。目前市場上的FMD疫苗大多數(shù)為滅活疫苗，通過用BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)獲得FMDV活毒，然后經(jīng)二元乙烯亞胺（BEI）滅活再純化，最后使用適當(dāng)?shù)淖魟┤缬突驓溲趸X/皂苷配制而成。滅活疫苗的生產(chǎn)需要嚴(yán)格的密封生物環(huán)境和昂貴的生物控制設(shè)施，在病毒滅活過程中存在病毒逃逸的生物安全隱患，并且出現(xiàn)不完全滅活而導(dǎo)致在接種疫苗的動(dòng)物中引起FMDV感染[28]；此外，F(xiàn)MD滅活疫苗在動(dòng)物注射部位容易形成肉芽腫，免疫保護(hù)期短，并且在不同血清型FMDV之間沒有交叉保護(hù)作用[29,30]；接種滅活疫苗只能降低感染率，但并不能阻止病毒的復(fù)制和傳播。研究表明，F(xiàn)MDV可在接種滅活FMD疫苗的動(dòng)物的上皮表面進(jìn)行病毒復(fù)制，導(dǎo)致接種滅活疫苗的動(dòng)物持續(xù)感

趨化因子和生長因子[46]（圖3），肥大細(xì)胞可通過這些活性物質(zhì)對周圍的細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。圖3 活化的肥大細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子調(diào)節(jié)周圍細(xì)胞功能Fig.3 Activated mast cells secrete a variety of cytokines, chemokines, and growth factors to regulate peripheral cellfunction[46]活化的肥大細(xì)胞分泌活性物質(zhì)可直接作用于感染部位的血管和毛細(xì)淋巴管從而改變二者通透性，募集中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等進(jìn)入感染病灶或引流淋巴結(jié)（圖4），而且肥大細(xì)胞還可通過分泌TNF-α和CCL20募集激活樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）并促進(jìn)抗原提呈[47]。
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本文編號：2841199