急性腎損傷(AKI)是由多種病因引起的高致死率的臨床綜合征,也是臨床常見的急危重癥之一,其醫(yī)療費用高昂,且目前尚缺乏有效的預(yù)防和治療措施。正是由于上述原因AKI已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注,并成為全世界需要共同面對與亟待解決的公眾健康問題。大量文獻報道,藥物性腎損傷(DKI)是引起AKI的重要原因之一,特別是抗生素和抗腫瘤類藥物對腎臟都有著嚴重的副作用,且在臨床藥物性腎損傷病例中順鉑(CDDP)和慶大霉素(GM)所引起的AKI所占比例較大。因此,科研工作者常利用這兩類藥物副作用建立動物模型進行腎損傷相關(guān)研究。AKI不僅危害人類的健康,同時對畜禽業(yè)也造成了危害。畜禽消化道細菌感染是危害養(yǎng)殖業(yè)的主要問題之一,沙門菌、大腸埃希菌等畜禽腸道細菌感染所致疾病的流行日趨復(fù)雜,也越來越難以控制,且不斷出現(xiàn)新的流行與致病特點,不僅會造成嚴重的腸道疾病而且會引發(fā)死亡,造成極大的經(jīng)濟損失。氨基糖苷類抗生素因其具有良好的抗菌活性和較廣的抗菌譜而被經(jīng)常用于治療畜禽革蘭陰性菌感染,如沙門氏菌、大腸埃希菌等。GM是治療畜禽革蘭陰性菌感染最常見的氨基糖苷類抗生素,但其嚴重的腎毒性限制了其在臨床上的應(yīng)用。在此背景下,本研究通過構(gòu)建CDDP和GM誘導(dǎo)的AKI動物模型進行腎損傷相關(guān)的機制及防治策略的研究無論在人醫(yī)還是獸醫(yī)都顯得尤為重要。大量研究已經(jīng)證實Nrf2信號通路是線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥的調(diào)節(jié)因子,是AKI的潛在治療靶點,Nrf2的藥理活化可能為AKI的臨床防治提供新療法。近年來,天然產(chǎn)物作為一種主要的Nrf2激活劑可以通過多種途徑對抗氧化應(yīng)激,調(diào)節(jié)Nrf2/ARE通路,用于各種疾病的防治與治療在國內(nèi)外已成為重要的研究方向。瑞香素(Daphnetin,Daph)是一種天香豆素衍生物,作為Nrf2的激活劑在臨床上對某些疾病的防治可能有很好的療效,但目前關(guān)于其在CDDP和GM刺激誘導(dǎo)的AKI的保護作用和機制還不清楚。本實驗選用CDDP在HK2細胞和C57BL/6J小鼠分別構(gòu)建體外和體內(nèi)兩種模型,探究瑞香素在體內(nèi)外對CDDP誘導(dǎo)AKI的保護作用和機制。在HK2細胞,我們用CDDP誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、凋亡和炎癥反應(yīng)來研究其在細胞中的抗氧化、抗凋亡和抗炎作用及機制,以及在人卵巢癌細胞系A(chǔ)2780、OVCAR-8和SKOV3細胞和人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549和H1299細胞分別檢測瑞香素對CDDP抗癌活性的影響,在此過程中主要應(yīng)用CCK8法、Hoehcst/PI染色法、流式細胞術(shù)(FCM)和免疫印跡法(Western Blot)等分子生物學(xué)方法。在C57BL/6J小鼠,我們用CDDP刺激小鼠構(gòu)建AKI模型,檢測瑞香素在CDDP誘導(dǎo)的小鼠AKI模型中的保護作用,并在細胞實驗基礎(chǔ)上進一步探究了其在小鼠AKI模型中氧化應(yīng)激、凋亡和炎性損傷的保護機制,在這一基礎(chǔ)上我們利用基因敲除小鼠再次探究其抗氧化機制、抗凋亡機制和抗炎機制三者之間的相互關(guān)系,以及構(gòu)建C57BL/6J小鼠背部皮下B16黑色素腫瘤模型來研究瑞香素對CDDP腫瘤殺傷活性的影響,在此過程中主要應(yīng)用HE染色、TUNEL染色和Western Blot等分子生物學(xué)方法。另外,再利用GM在m TEC細胞和ICR小鼠分別構(gòu)建體外和體內(nèi)兩種模型,探究瑞香素在體內(nèi)外對GM誘導(dǎo)AKI模型的保護作用和機制。在m TEC細胞,我們用GM誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激和凋亡觀察其體外抗氧化和抗凋亡活性及機制。在此過程中主要應(yīng)用CCK8法、Hoehcst/PI染色法和Western Blot等分子生物學(xué)方法。在ICR小鼠,我們用GM刺激小鼠構(gòu)建AKI模型,檢測瑞香素在GM誘導(dǎo)小鼠AKI模型中的保護作用,并在細胞實驗基礎(chǔ)上進一步探究了其在小鼠AKI模型中氧化應(yīng)激和凋亡損傷的保護機制。在此過程中主要應(yīng)用HE染色和Western Blot等分子生物學(xué)方法。實驗結(jié)果表明:1.在HK2細胞中瑞香素展示出良好的抗氧化和抗凋亡活性,具體表現(xiàn)在其顯著抑制CDDP誘導(dǎo)的細胞毒性、細胞凋亡和ROS的產(chǎn)生。瑞香素還上調(diào)了SIRT1/SIRT6/Nrf2/ARE通路并由此介導(dǎo)了其抗氧化活性,同時它還通過對MAPK、NF-κB和p53通路的抑制作用而發(fā)揮抗炎和抗凋亡活性。2.在m TEC細胞中瑞香素展示出良好的抗氧化和抗凋亡活性,具體表現(xiàn)在其顯著抑制GM誘導(dǎo)的細胞毒性、細胞凋亡和ROS的產(chǎn)生。瑞香素上調(diào)了SIRT3/Nrf2/ARE通路并可能由此介導(dǎo)了其抗氧化活性。3.在C57BL/6J野生型小鼠,瑞香素顯著改善了小鼠AKI模型中CDDP誘導(dǎo)的小鼠體重減輕,降低了腎指數(shù)、血BUN和CRE的升高,減輕小鼠腎腫大變白的程度以及腎組織的病理改變,還降低了腎組織中MPO和MDA的產(chǎn)生以及GSH和SOD的消耗。上述瑞香素的這些保護作用可能與其上調(diào)腎組織中SIRT1/SIRT6/Nrf2/ARE通路和抑制CDDP誘導(dǎo)的MAPK、NF-κB和p53通路的活化密切相關(guān)。4.相比于C57BL/6J野生型小鼠,Nrf2-/-小鼠的AKI模型中小鼠的體重減輕,腎指數(shù)、血BUN和CRE的升高,腎組織病理的改變,腎腫大變白的程度以及MAPK、NF-κB和p53通路的激活作用尤為明顯,而給予瑞香素治療后上述現(xiàn)象并未得到改善,表明了瑞香素在CDDP誘導(dǎo)的小鼠AKI模型中的保護作用及抗氧化、抗凋亡和抗炎活性均依賴Nrf2的介導(dǎo)。5.瑞香素不影響CDDP在人卵巢癌細胞系A(chǔ)2780、OVCAR-8和SKOV3細胞和人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549和H1299細胞的抗癌活性,以及C57BL/6J小鼠背部皮下B16黑色素腫瘤模型的腫瘤殺傷活性。6.在ICR小鼠,瑞香素顯著改善了小鼠AKI模型中GM誘導(dǎo)的小鼠血BUN和CRE的升高、腎組織病理的改變、小鼠腎腫大變白的程度,還降低了腎組織中MPO和MDA的產(chǎn)生以及GSH和SOD的消耗。上述瑞香素的這些保護作用可能與其上調(diào)腎組織中SIRT3/Nrf2/ARE通路和抑制GM誘導(dǎo)的p53通路的活化密切相關(guān)。綜上所述,瑞香素通過上調(diào)SIRT1/SIRT3/SIRT6/Nrf2/ARE通路,從而抑制氧化應(yīng)激、凋亡和炎癥及線粒體功能紊亂,進而在CDDP/GM誘導(dǎo)的小鼠AKI模型中起到保護作用。因此,瑞香素有望同時應(yīng)用于人類和動物中各種藥物毒副作用的防治,從而改變或提高機體的抗病能力,保障人類的身體健康及減少畜禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S853.74
【部分圖文】：

1.3.1 瑞香素明顯改善 CDDP 誘導(dǎo)的 HK2 細胞形態(tài)改變和細胞毒性HK2細胞經(jīng)不同濃度瑞香素預(yù)處理1 h后，給予CDDP刺激24 h，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，結(jié)果如圖1.1所示，正常未處理的HK2細胞排列規(guī)則、均勻，細胞數(shù)量增加；與正常HK2細胞相比，單給CDDP刺激組細胞發(fā)生了明顯的改變，具體表現(xiàn)為細胞死亡明顯增多，活細胞數(shù)量則明顯減少，且細胞出現(xiàn)明顯的損傷如細胞核固縮、碎裂，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，細胞皺縮且貼壁能力減弱；而給予不同濃度瑞香素組的HK2細胞的細胞損傷得到不同程度的改善，特別是瑞香素高劑量組。與之一致的是CCK8法測定的細胞存活率

特別是瑞香素高劑量組尤為明顯，呈劑量依賴性，且不同濃度瑞香素組間在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。圖1.2 瑞香素對CDDP誘導(dǎo)的HK2細胞凋亡的影響（Hoechst/PI染色）HK2細胞經(jīng)不同濃度瑞香素預(yù)處理1 h后，給予CDDP刺激24 h，經(jīng)Hoehcst/PI染色15min立即用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)和PI陽性細胞數(shù)。注， CDDP模型組與空白組相比，**P <0.01。Daph治療組與CDDP模型組相比，#P < 0.05和##P < 0.01。1.3.3 瑞香素顯著抑制 CDDP 誘導(dǎo)的 HK2 細胞凋亡HK2 細胞經(jīng)不同濃度瑞香素預(yù)處理 1 h 后給予 CDDP 刺激 24 h，收集細胞并采用 FITC 和 PI 染色法，檢測瑞香素對 CDDP 誘導(dǎo) HK2 細胞凋亡/壞死的保護作用。如圖 1.3 可見：與空白對照組相比

呈劑量依賴性，且不同濃度瑞香素組間在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。圖1.3 瑞香素對CDDP誘導(dǎo)的HK2細胞凋亡的影響HK2細胞經(jīng)不同濃度瑞香素預(yù)處理1 h后，給予CDDP刺激24 h，收集細胞并采用FITC和PI染色法運用流式細胞儀檢測瑞香素對CDDP誘導(dǎo)HK2細胞凋亡/壞死的保護作用。注，
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本文編號：2836110