肌內(nèi)脂肪含量影響肉質(zhì)的嫩度、多汁性及風(fēng)味,如何提高肌內(nèi)脂滴發(fā)育讓更多的脂質(zhì)沉積到肌肉中成為生產(chǎn)者及科研工作者共同關(guān)注的話題。近年來,隨著多種組學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展,脂滴的純化技術(shù)越來越受到關(guān)注。分離純化獲得具有生物學(xué)活性,并且純度較高的脂滴是保證其生物學(xué)功能研究可靠性的前提。本研究分析不同屠宰體重對(duì)肉品質(zhì)的影響,建立豬背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂滴的超速離心分離純化的方法,并對(duì)分離脂滴進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及純度驗(yàn)證,為研究豬肌內(nèi)脂肪生成和分子調(diào)控機(jī)制提供技術(shù)支撐。對(duì)研究肌肉中脂質(zhì)的沉積,改善豬肉品質(zhì)及食用價(jià)值,生產(chǎn)有益于人體健康的肉制品具有重要意義。本試驗(yàn)結(jié)果如下:1.為了研究不同屠宰體重下肌內(nèi)脂肪含量對(duì)豬胴體性狀及肉品質(zhì)特性的影響,試驗(yàn)選取90±2.0 kg與120±2.0 kg的“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交肥育豬屠宰后對(duì)其肌內(nèi)脂肪、肉品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分分析。結(jié)果顯示:120 kg體重與90 kg體重屠宰時(shí)相比,1)隨著體重的增加,肌內(nèi)脂肪含量顯著增加;2)隨著體重的增加120 kg體重屠宰時(shí)極顯著的提高了胴體重、背膘厚度、眼肌面積、屠宰率等指標(biāo)(P0.01)。3)隨著屠宰體重的增加極顯著提高了豬肉肉色(P0.01),降低了失水率和蒸煮損失,顯著提高了肌肉剪切力(P0.05)。4)120 kg體重屠宰時(shí)顯著提高了不飽和脂肪酸的含量(P0.05)和顯著降低了飽和脂肪酸的含量(P0.05)。5)隨著體重的增加120kg體重屠宰時(shí)顯著提高了必需氨基酸的含量(P0.05),極顯著的提高了鮮味氨基酸的含量(P0.01)。2.為了建立豬背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂滴分離純化的方法,本研究首次嘗試分離豬肌內(nèi)脂滴并進(jìn)行純化的方法。將背最長(zhǎng)肌組織樣品進(jìn)行不同超速離心速度獲得肌內(nèi)脂滴,經(jīng)過油紅O染色鑒定為形態(tài)完整的油滴。提取脂滴蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色鑒定脂滴蛋白的純度較高。然后,通過Western blot技術(shù)檢測(cè)脂滴中是否存在線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜等細(xì)胞器,進(jìn)一步驗(yàn)證脂滴純度。結(jié)果表明:采用超速離心法分離純化豬背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂滴,通過形態(tài)學(xué)觀察及Western blot技術(shù)驗(yàn)證脂滴純度,表明這種方法能夠分離出純度較高的肌內(nèi)脂滴。3.為研究豬肌內(nèi)脂滴蛋白對(duì)脂質(zhì)沉積及分解代謝的調(diào)控機(jī)制,本試驗(yàn)以分離純化脂滴為切入點(diǎn),觀察肌內(nèi)脂滴的形態(tài)大小及數(shù)量,將提取脂滴蛋白利用Western blot技術(shù)檢測(cè)調(diào)控脂滴代謝的關(guān)鍵因子的表達(dá)水平。結(jié)果表明:隨著育肥豬體重的增加,體重120kg肌內(nèi)脂滴的體積增大,脂滴內(nèi)的脂滴代謝相關(guān)蛋白極顯著增加。綜上所述,“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交育肥豬在體重120 kg左右的屠宰時(shí)比體重90 kg肌內(nèi)脂肪含量顯著增加,提高了豬肉肉質(zhì)性狀及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。采用超速離心法分離純化豬背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂滴,能夠獲得形態(tài)較好、純度較高的肌內(nèi)脂滴。隨著育肥豬體重的增加肌內(nèi)脂滴的體積不斷增大,調(diào)控脂滴表面脂質(zhì)沉積及降解的代謝蛋白也增加,共同調(diào)控脂滴的代謝平衡。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

離心 30 min。離心后上層漂浮的白色物質(zhì)即為脂滴（ 1.0 mL 用于脂滴蛋白純度的檢測(cè)（PNS2）。然后在 4℃，90,清液（PNS3）（圖 4-1 D）。將上層脂滴移入另一個(gè)無菌的 4離心管中加入 BufferB，并用移液槍小心吹打聚集成團(tuán)的脂這樣有利于除去脂滴間夾雜的其他細(xì)胞器或胞膜等（圖 4-1C離心 30 min，取 上清液（PNS4）（圖 4-1E）。得到更加純化的脂滴，小心收集上一步驟多次離心的脂滴2PA 離心管中，并且將脂滴在溶液中小心吹打成乳白色。4℃，注意：離心的轉(zhuǎn)速過高會(huì)導(dǎo)致脂滴破碎，速度過低則得不到清液（PNS5）并收集上層漂浮的脂滴，盡量避免抽取下層的 的離心管中（圖 4-1F）。此時(shí)，如果脂滴用于觀察形態(tài)置于-4 Western blots 及組學(xué)分析則放入-80℃冰箱內(nèi)保存，防止蛋白

圖 4-2 豬肌內(nèi)脂滴、油紅 O 染色、BODIPY 染色圖圖 A 為肌內(nèi)脂滴形態(tài)圖（40×）；圖 B（10×）和 C（40×）油紅 O 染色圖；圖 D （10×）BODIPY熒光染色脂滴形態(tài)圖Figure.4-2 Lipid droplets and oil red O staining and bodipy fluorescence staining profiles ofintramuscular fat in pigsFigure. A Intramuscular lipid droplet profiles (40×); Figure B (10×) and figure C (40×) Oil red Ostaining and figure D bodipy fluorescence staining lipid droplets profiles of intramuscular fat4.4 考馬斯亮藍(lán)染色蛋白的鑒定將不同離心力獲得的細(xì)胞漿（Cyto）、上清液（PNS1-5）及脂滴（LDs）蛋白由SDS-PAGE 分離蛋白后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。圖 4-3 結(jié)果顯示：經(jīng)過多次超速離心后獲得的脂滴蛋白不同于 Cyto 及 PNS 蛋白組成，但是第三次離心獲得的 PNS3 蛋白表達(dá)譜開始與 LDs 蛋白相似。LDs 蛋白中包含 5 種主要的蛋白條帶，Image J 分析主要脂滴相關(guān)蛋白量近 54.24%。LDs 經(jīng)過 5 次反復(fù)清洗、離心，最終獲得的 LDs 蛋白輪廓與 PNS4

熒光染色脂滴形態(tài)圖-2 Lipid droplets and oil red O staining and bodipy fluorescence staintramuscular fat in pigsntramuscular lipid droplet profiles (40×); Figure B (10×) and figured figure D bodipy fluorescence staining lipid droplets profiles of intra藍(lán)染色蛋白的鑒定力獲得的細(xì)胞漿（Cyto）、上清液（PNS1-5）及脂滴蛋白后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。圖 4-3 結(jié)果顯示：經(jīng)過多同于 Cyto 及 PNS 蛋白組成，但是第三次離心獲得的 相似。LDs 蛋白中包含 5 種主要的蛋白條帶，Image 24%。LDs 經(jīng)過 5 次反復(fù)清洗、離心，最終獲得的 LDs 輪廓相似，與 Ding（2012）研究結(jié)果一致。所以，本已經(jīng)適合進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
【參考文獻(xiàn)】

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