我國具有獨特和豐富的小型豬資源。其中廣西巴馬小型豬與人相比,其基因組同源性高達83%,在生理學、疾病發(fā)生機理、解剖學等方面與人類又相似,因此,小型豬是研究人體生理、病理機制和異種器官移植的理想實驗動物模型[1]。廣西巴馬小型豬作為具有代表性的實驗用小型豬之一,其具有體型矮小、性成熟較早、生長速度比大型瘦肉型豬種緩慢的特點。影響動物生長發(fā)育的因素較多且復雜,遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境以及激素等諸多因素對生長發(fā)育的調(diào)控都是通過神經(jīng)內(nèi)分泌生長軸(GH-GHR-IGFs)來實現(xiàn)的。有研究表明,廣西巴馬小型豬血清中GHR和IGF-I的濃度極顯著低于杜洛克、約克夏和長白豬,但血清中GH濃度在4個品種之間沒有顯著差異�；虻霓D(zhuǎn)錄是一個非常關(guān)鍵的階段,它在遺傳信息傳遞的過程中起著“橋梁”作用。轉(zhuǎn)錄的起始時間、起始位點和頻率受到啟動子這一重要元件的調(diào)控。啟動子主要是通過與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控作用的。為探索豬GHR基因啟動子SNP位點與GHR表達的關(guān)系,本實驗克隆了 2個廣西地方豬種和3個國外豬種GHR基因啟動子序列,篩選地方豬種與國外豬種差異SNP位點,研究差異SNP位點對GHR表達的影響,主要的研究結(jié)果如下:1.運用PCR擴增廣西巴馬小型豬(n=48)、陸川豬(n=28)、長白豬(n=42)、杜洛克豬(n=45)、大白豬(n=40)GHR基因啟動子區(qū)約1300bp序列,測序后進行序列對比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GHR啟動子上游區(qū)-758位點,廣西巴馬小型豬和陸川豬均為A,而長白豬、杜洛克豬和大白豬均為G。應用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點在線預測軟件預測發(fā)現(xiàn),該位點是AP-2α轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。2.成功構(gòu)建廣西巴馬小型豬GHR基因啟動子核心區(qū)域-758位點突變型(-758 A→G)和野生型(-758 A)雙熒光素酶報告基因載體,并轉(zhuǎn)染PK15和C2C12細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),廣西巴馬小型豬突變型基因載體的啟動子活性顯著高于野生型載體的啟動子活性(p0.05)。3.成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子AP-2α基因的超表達載體pcDNA3.1-AP-2α,轉(zhuǎn)染PK15細胞后定量檢測細胞中AP-2α和GHR基因的相對表達情況。結(jié)果顯示,超表達AP-2α基因后,AP-2α基因的相對表達量顯著上升(p0.01),GHR基因的相對表達量也顯著上升(p0.01)。4.將廣西巴馬小型豬突變型(-758 A→G)和野生型(-758 A)GHR基因啟動子雙熒光素酶報告基因載體與轉(zhuǎn)錄因子超表達載體pcDNA3.1-AP-2α共轉(zhuǎn)PK15細胞后發(fā)現(xiàn),廣西巴馬小型豬GHR基因啟動子突變型載體和pcDNA3.1-AP-2α共轉(zhuǎn)組(實驗組)的啟動子活性顯著高于廣西巴馬小型豬突變載體和pcDNA3.1共轉(zhuǎn)組(對照組)(p0.05);廣西巴馬小型豬野生型載體和pcDNA3.1-AP-2α共轉(zhuǎn)組(實驗組)的啟動子活性也顯著高于廣西巴馬小型豬野生型載體和pcDNA3.1共轉(zhuǎn)組(對照組)(p0.05)。AP-2α過表達上調(diào)突變型(-758A→G)啟動子的活性的程度顯著高于野生型(-758 A)(p0.01)。5.針對豬PK15腎細胞,設(shè)計了 5個shRNA載體用于內(nèi)源性AP-2αα基因表達的干擾實驗。shRNA載體轉(zhuǎn)染PK15細胞后定量檢測AP-2α基因和GHR基因的表達情況。結(jié)果顯示,干擾AP-2α基因表達后,AP-2α基因的表達量顯著下降(p0.01),GHR基因的表達量也顯著下降(p0.01)。6.針對廣西巴馬小型豬GHR基因啟動子中轉(zhuǎn)錄因子AP-2α結(jié)合位點的DNA堿基序列,設(shè)計了相應的生物素標記探針、冷競爭性探針和突變探針并進行EMSA實驗。EMSA實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子AP-2α能與所設(shè)計的探針相結(jié)合,證明轉(zhuǎn)錄因子AP-2α能夠靶向GHR基因啟動子上其相應的結(jié)合位點。
【學位單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

所有成員在其Ｃ－末端都具有高度保守的螺旋－跨越－螺旋（ＨＳＨ）邋ＤＮＡ結(jié)合和二聚化結(jié)逡逑構(gòu)域，并且在其Ｎ－末端具有較不保守的富含脯氨酸和富含谷氨酰胺的反式激活結(jié)構(gòu)域＾逡逑（如圖１－１所示）。大多數(shù)異構(gòu)體在Ｎ－末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域中也具有ＰＹ基序（ＸＰＰＸＹ），逡逑這對于它們作為轉(zhuǎn)錄激活因子的作用是重要的［６氣ＡＰ－２因子只有形成同源二聚體或異逡逑二聚體才有調(diào)控轉(zhuǎn)錄的活性。螺旋－跨越－螺旋基序與基本區(qū)域一起介導ＤＮＡ結(jié)合逡逑脯氨酸和谷氨酰胺酸區(qū)負責反式激活。在各種細胞和病毒增強子中，ＡＰ－２結(jié)合到回文逡逑共識序列Ｓｉ－ＧＣＣｌ＾ＧＧＣＧ’ＷＭ；在體外的結(jié)合位點選擇實驗揭示另外的結(jié)合序列逡逑５，－ＧＣＣＮ３ＧＧＣ－３，，５，－ＧＣＣＮ４ＧＧＣ－３＇和邋Ｓ＇－ＧＣＣＮＭＧＧＧｄ６３，６４］。與這些序列基序不同逡逑的其它結(jié)合位點，例如ＳＶ４０增強子元件５＇－ＣＣＣＣＡＧＧＣ－３＠５】，表明ＡＰ－２蛋白可能與逡逑一系列具有可變親和力的富含Ｇ／Ｃ的元件結(jié)合。在其啟動子序列中具有ＡＰ－２結(jié)合位點逡逑的靶基因參與諸如細胞生長和分化的生物過程，并且包括例如編碼胰島素樣生長因子結(jié)逡逑合蛋白５邋（邋ＩＧＦＢＰ５邋）結(jié)合位點５＇－ＧＣＣＡＧＧＧＧＣ－３＿］，前胸腺激素ａ逡逑（５，－ＧＣＣＧＧＴＧＧＧＣ－３，）［６７］，雌激素受體（５，－ＧＣＣＴＧＣＧＧＧＧ－３，）［６８］。逡逑７逡逑

的廣西巴馬小型豬ＧＨＲ基因啟動子序列為模板，利用Ｐｒｉｍｏｅｒ邋５．０和Ｏｉｉｇｏ７軟件設(shè)計３逡逑對引物，對在啟動子上面的轉(zhuǎn)錄因子ＡＰ－２ａ結(jié)合位點序列進行定點突變，引物序列詳逡逑細信息如表２－１所示，定點突變流程圖，如圖２－１所示，引物由華大基因合成。逡逑１２逡逑

２．３．１基因組ＤＮＡ的提取逡逑用紫外分光光度計檢測豬基因組ＤＮＡ樣品的濃度，將檢測合格的樣品進行１％瓊逡逑脂糖凝膠電泳檢測，如圖２－１所示，泳道內(nèi)的基因組ＤＮＡ樣品條帶明亮單一無雜帶，逡逑可做為后續(xù)實驗所需。逡逑圖２－２豬基因組ＤＮＡ電泳圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｐｏｒｃｉｎｅ邋ｇｅｎｏｍｉｃ邋ＤＮＡ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｍａｐ逡逑２４逡逑

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本文編號：2829332