豬流行性感冒(Swine influenza,SI)是由A型流感病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性感染的呼吸道傳染病。其臨床癥狀為突然發(fā)病、咳嗽、噴嚏、流涕、呼吸困難、發(fā)熱、衰竭、食欲下降和生長緩慢等。該病發(fā)病率高、傳染性強,單純感染時死亡率并不高,但在短時間內可波及全群,對豬的生長性能造成不良的影響;若與其他病原混合感染,會使死亡率增高,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失。目前對于豬流感的防控主要通過免疫接種進行,但我國市場上豬流感疫苗的種類非常少,且交叉保護力不強。本研究通過分離國內流行的H3N2亞型豬流感病毒,針對滅活劑及佐劑進行優(yōu)化,并制備成滅活疫苗,同時對該滅活疫苗進行免疫效力的評估,以提供一種安全有效的豬流感滅活疫苗,減少本病對養(yǎng)豬業(yè)造成的經濟損失。本研究從黑龍江省某豬場采集的疑似豬流感發(fā)病豬的鼻拭子13份,經過處理后,接種至10~11日齡SPF雞胚,分離到一株具有血凝性的病毒。通過血清學鑒定、分子生物學鑒定、電鏡觀察、生物學特性及理化特性等方法對該病毒進行鑒定,結果可見分離株對雞紅細胞的凝集價為1:256,且僅能被H3亞型豬流感陽性血清中和,RT-PCR鑒定結果為H3、N2亞型;電鏡下病毒粒子呈球形,直徑約為80~120nm,有囊膜,表面有刺突和纖突,對雞胚的半數感染量(EID_(50))為10~(-6.38)EID_(50)/0.1mL;該病毒對熱、氯仿以及乙醚均敏感;從上述對病毒特性的研究,判定分離的病毒為H3N2亞型豬流感病毒。利用10~11日齡SPF雞胚制備制苗用病毒液,用終濃度為0.2%二乙烯亞胺(BEI)滅活病毒,將其乳化制成油乳劑滅活疫苗,用血清學方法和免疫攻毒方法對該疫苗的免疫效力進行評估,并測定了疫苗的免疫期。結果可見該滅活疫苗的免疫效力良好,與市售豬流感滅活疫苗比較,可見兩者免疫期相同,且本疫苗的免疫效力在一定程度上優(yōu)于市售疫苗。由此可見該毒株可以作為一株優(yōu)質的制苗用備選毒株,為豬流感疫苗的研制奠定基礎。
【學位單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

東北農業(yè)大學獸醫(yī)碩士學位論文ine/ACheng/5/2016(H3N2)[24]。豬流感病毒（Swine influenza Virus，SIV）粒子呈多形性，在初次分離時為絲狀，一，經雞胚培養(yǎng)傳代后均呈球狀，直徑約為 80～120 nm[25,26]。病毒具有囊膜，囊膜定病毒吸附紅細胞功能的血凝素（haemagglutinin，HA）和幫助新病毒粒子從細胞來的神經氨酸酶（neuraminidase，NA）兩種刺突狀糖蛋白以及跨膜的基質蛋白（ins，M2）組成，HA 約為 NA 的 4～5 倍[27]�；|蛋白 M1 位于囊膜類脂雙層內側外側，以維持病毒形態(tài)。病毒的核衣殼由核蛋白（nucleoprotein, NP）構成，其內含 RNA、三種聚合酶蛋白（PB1、PB2、PA）以及非結構蛋白（nonstructural proteinsPB2、PA 的分子質量在流感病毒各亞單位蛋白中是最大的，且在被感染的細胞的，均發(fā)現了 PA、PB2 和 PB1 成分。NS 由 NS1 和 NS2 組成，當病毒感染細胞后，檢出大量 NS1、胞漿內可檢出大量 NS2，但病毒粒子中則不再存在[28-32]。病毒基本圖見圖 1-1[33]。

好的病料上清液，接種于 10~11 日齡 SPF 雞胚，接種量為 0.2ml/胚，35℃持為 60~65%）培養(yǎng)，每日檢胚 2 次，棄去 24h 內死亡的雞胚，24h 后死亡至 72h 取出全部雞胚，置 2~8℃冷卻 12h，收獲雞胚尿囊液，進行紅細胞 份病料接種的雞胚盲傳 2 代時，收獲的雞胚尿囊液出現紅細胞凝集，效價為釋法接種 10~11 日齡雞胚檢測半數雞胚感染量為 10-5.68EID50/0.1ml，結果見的胚體出現水腫、出血點等病理變化，結果見圖 3-1。表 3-1 病毒 EID50測定結果Tab .3-1 Results of virus EID50measurement度tion接種雞胚數Inoculation holesCPE+CPE－積累Accumulation CPE 率百分PerceCPE+CPE－5 5 0 11 0 11/11 105 4 1 6 1 6/7 855 2 3 2 4 2/6 335 0 5 0 9 0/9 0

東北農業(yè)大學獸醫(yī)碩士學位論文明所分離的毒株為 H3 亞型豬流感病毒，并將該分離株命名為 AC 株。表 3-2 紅細胞凝集抑制試驗鑒定結果Tab.3-2 The indentification result of Hemagglutination inhibition test代次generation陽性抗血清Positive antiserumH1 H3 H5 H9F5 - + - -注：“+”陽性反應；“-”陰性反應Note:“+”positive reaction, “-”negative reaction..2.2 病毒的分子生物學鑒定將豬流感病毒 AC 株用所合成的引物進行流感病毒亞型的鑒定。由圖 3-2, 3-3 可以看出 H3 U/L、和 N2 U/L 擴增出了與預期擴增片段大小一致的條帶，表明該樣品的 HA 為 H3型，NA 為 N2 亞型。

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 竇成利;于凱源;于喜冰;;流感疫苗研究進展[J];現代畜牧獸醫(yī);2015年10期

2 王一鳴;應瑛;陳小慶;李響;趙艷麗;胡桂學;;二乙烯亞胺和甲醛對貓杯狀病毒滅活效果比較研究[J];中國獸藥雜志;2015年09期

3 楊科偉;王鎖榮;;豬流感疫苗應用研究進展[J];當代畜牧;2015年20期

4 張智明;王全杰;竇海艷;孟福強;梁宛楠;丁國杰;;二乙烯亞胺對豬偽狂犬病病毒滅活效果研究[J];中國獸藥雜志;2015年06期

5 蔣康富;白娟;李玉峰;王先煒;姜平;;腦心肌炎病毒滅活疫苗佐劑的篩選及其效力評價[J];中國獸醫(yī)學報;2015年02期

6 朱飛;;豬病的癥狀及治療方法[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2014年12期

7 趙顯威;邵善英;鄒紅梅;胡翠清;;豬流感的生物學特性及診斷方法[J];新農業(yè);2014年11期

8 王偉利;孟慶峰;叢彥龍;冉偉;朱利塞;楊金生;錢愛東;;歐亞類禽H1N1與古典H1N1亞型豬流感病毒NA基因遺傳進化分析[J];中國獸醫(yī)學報;2014年04期

9 白昀;馮志新;甘源;劉占軍;張旭;韋艷娜;馬慶紅;邵國青;;一株H1N1亞型豬流感病毒的分離鑒定及生物學特性分析[J];中國預防獸醫(yī)學報;2013年07期

10 秦智鋒;張彩虹;孫潔;劉建利;盧體康;阮周曦;林慶燕;呂建強;曹琛福;曾少靈;陳書琨;廖立珊;花群義;;甲型H1N1(2009)流感病毒實時熒光RT-PCR檢測方法的建立與評價[J];中國預防獸醫(yī)學報;2013年01期

相關博士學位論文 前1條

1 于海;中國部分地區(qū)豬流感病毒的分子流行病學研究[D];中國農業(yè)科學院;2008年

相關碩士學位論文 前5條

1 劉清政;一株H1N1亞型豬流感病毒的分離鑒定及其脂質體疫苗的制備[D];山東農業(yè)大學;2017年

2 何淑儀;華南地區(qū)豬場流感病毒血清學調查及重組H3N2亞型SIV候選疫苗株的初步研究[D];華南農業(yè)大學;2016年

3 王晶;流感病毒宿主特異性研究[D];吉林大學;2014年

4 朱春平;H3N2亞型豬流感病毒10個基因的原核表達及抗HA蛋白單抗雜交瘤細胞株的建立[D];河南農業(yè)大學;2014年

5 王俊亞;河南省豬流感病毒的分離鑒定及生物學特性研究[D];河南農業(yè)大學;2013年

本文編號：2829114