奶牛性控冷凍精液人工授精的性控繁育技術可以快速增加良種奶牛數(shù)量,提升奶牛養(yǎng)殖經(jīng)濟效益,是目前奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化推廣應用最成功、最有效的繁育生物技術手段。奶牛缺陷精子包括形態(tài)畸形與頂體破損、DNA缺陷、死精子三種類型。奶牛精液中的缺陷精子直接影響奶牛種公牛遺傳資源利用率、性控冷凍精液生產(chǎn)效率及其人工受精的受胎率。本研究旨在通過特異性蛋白鑒別三種奶牛精液中的缺陷精子,然后與免疫磁珠結(jié)合在X"Y精子性控分離前去除缺陷精子,提高奶牛性控冷凍精液生產(chǎn)效率及產(chǎn)品中的正常精子比例,促進該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化應用效果,同時為人工輔助生殖等相關方面的研究和應用提供一定的實驗依據(jù)。本研究共分兩部分:第一部分為畸形與頂體破損、DNA缺陷奶牛精子的鑒別及結(jié)合免疫磁珠方法的奶牛精液中缺陷精子去除技術研究。首先分析確認奶牛精子泛素化水平同精子畸形及精子DNA缺陷的相關性。實驗結(jié)果顯示,通過western blotting和單通道流式細胞法檢測均證明奶牛精子泛素化水平同精子畸形率具有顯著相關性(p0.05);進一步通過雙通道流式細胞法檢測結(jié)果表明,奶牛精子泛素化水平同精子DNA缺陷水平具有顯著相關性(p0.05)。在此基礎上,選擇抗泛素化蛋白作為特異抗體,設計了結(jié)合免疫磁珠抗泛素化蛋白去除奶牛精液中的畸形與頂體破損、DNA缺陷精子的技術流程。實驗結(jié)果表明該技術流程可以有效去除奶牛精子中的畸形和頂體破損精子(p0.05)。結(jié)論:利用特異性抗泛素化蛋白與免疫磁珠結(jié)合,可以在X"Y精子性控分離前明顯去除奶牛精液中的畸形和頂體破損缺陷精子,提高奶牛性控冷凍精液產(chǎn)品質(zhì)量。第二部分為奶牛死精子與膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)的特異性結(jié)合確認及免疫磁珠方法去除奶牛死精子的應用技術研究。實驗研究結(jié)果表明,Annexin V可以與奶牛死精子進行特異性結(jié)合。據(jù)此選擇Annexin V作為奶牛死精子的特異標記,然后設計利用免疫磁珠結(jié)合Annexin V去除奶牛精液中死精子的技術流程。實驗結(jié)果顯示分選后精子的活力、膜完整性、線粒體活性和X"Y分離死精率均有不同幅度的改善,說明該技術流程設計可以有效去除部分死精子,但是對于分離后的X或Y精子制備的性控冷凍精液各項指標均沒有明顯影響(p0.05)。結(jié)論:利用膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)的特異性結(jié)合免疫磁珠方法可以有效去除奶牛精液中的死精子,顯著降低性控分離時的奶牛精子死精率(p0.05),有效提高奶牛性控冷凍精液生產(chǎn)效率、降低了生產(chǎn)成本,推動了該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化應用。
【學位單位】：內(nèi)蒙古大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S823
【部分圖文】：

內(nèi)蒙古大學博士學位論文2.12 精子膜完整性檢測加80μL現(xiàn)配的6-CFDA/PI染色液至20μL 精液樣品中，然后37℃水浴鍋避光溫育10min。孵育后 800g 離心 5min。然后取 30μL 的 0.01M PBS 重新懸浮，用移液器吸取取 15μL 精子混合液到干凈載玻片上，蓋玻片壓片，熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)精子所染熒光顏色差別判斷精子膜是否完整，每個樣品計數(shù) 200 個以上精子。被 6-CFDA 完全染成綠色的膜完整精子（FITC 濾光片下觀察）；被 PI 染成紅色的膜破損精子（Rcodamine 濾光片下觀察）；精子膜完整性 =總精子數(shù)膜完整精子數(shù)×100%

內(nèi)蒙古大學博士學位論文2.13 精子線粒體活性檢測加 80μL 現(xiàn)配的 MITO 染色液至 20μL 精液樣品中，37℃水浴鍋避光溫育 20min，然后在以上精液混合液中加入 500μL PBS 緩沖液，500g 離心 5min 后棄掉上清。然后取 30μL 0.01MPBS 重新懸浮，吸取 10μL 混合液到干凈載玻片上，蓋玻片壓片于熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)精子尾部中段線粒體區(qū)域是否有紅熒光辨別精子是否具有線粒體活性，每樣本計數(shù) 200 個以上精子。精子線粒體活性 =總精子數(shù)具有線粒體活性精子數(shù)×100%

內(nèi)蒙古大學博士學位論文然后用加一定量 PBS 溶液重懸，調(diào)整精子濃度至 1～2×106/mL。移液槍吸取 40μL 精子懸液涂片，空氣中自然干燥，用純甲醇固定 10 min，接著加入 50μL FITC-PNA 染液，37℃、陰暗潮濕環(huán)境下孵育至少 30 min 后用 PBS 溶液小心沖洗載玻片，待自然干燥后，加一定量增光劑并用無色指甲油封片。在 1000×熒光顯微鏡下鏡檢，通過熒光觀察頂體形態(tài)以判斷精子頂體是否完整。每次檢測時，每個樣本至少計數(shù) 200 個精子。精子頂體完整率 =總精子數(shù)頂體完整精子數(shù)×100%

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