小反芻獸疫是由副粘病毒科麻疹病毒屬中的小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)引起的,主要感染山羊和綿羊,臨床以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎等為特征,發(fā)病率和死亡率高達(dá)90%以上,為農(nóng)業(yè)部一類動(dòng)物疫病。PPRV是一種具有囊膜的RNA病毒,其復(fù)制和出芽機(jī)制尚不完全清楚。BST-2作為干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的天然免疫限制因子,在哺乳動(dòng)物成熟B細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、類漿樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中都有表達(dá)。為了研究BST-2在PPRV復(fù)制和出芽過(guò)程的作用機(jī)制,進(jìn)行了本論文研究。首先,根據(jù)GenBank中山羊BST-2的基因序列(登錄號(hào):XM_018051380.1)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,以pUC-gBST-2質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增山羊BST-2基因,并插入到pLOV-GFP-3×Flag載體,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pLOV-gBST-2。利用鈣轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pLOV-gBST-2、外膜質(zhì)粒pMD2.G和包裝質(zhì)粒psPAX2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲得一株gBST-2基因重組慢病毒。將含gBST-2基因的重組慢病毒感染Vero細(xì)胞,利用嘌呤霉素加壓篩選,獲得一株穩(wěn)定表達(dá)gBST-2蛋白的細(xì)胞系,命名為Vero-gBST-2細(xì)胞系。將該細(xì)胞系連續(xù)傳代15代,經(jīng)過(guò)PCR、RT-PCR、Western blot檢測(cè)表明Vero-gBST-2細(xì)胞系能穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)gBST-2蛋白,gBST-2蛋白主要定位在Vero細(xì)胞的細(xì)胞膜上。應(yīng)用PPRV感染Vero-gBST-2細(xì)胞系,進(jìn)一步研究gBST-2蛋白對(duì)PPRV增殖特性的影響,繪制PPRV在Vero-gBST-2細(xì)胞中的一步生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示,PPRV在Vero-gBST-2細(xì)胞系增殖不佳,病毒滴度降低,gBST-2蛋白能明顯地限制PPRV復(fù)制。PPRV感染后48h、72h、96h收取的細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)感染的Vero-gBST-2細(xì)胞中病毒粒子的產(chǎn)量減少。結(jié)果初步表明,gBST-2蛋白能限制PPRV的復(fù)制和出芽。應(yīng)用激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn),gBST-2蛋白與PPRV存在共定位。綜上所述,本研究構(gòu)建的Vero-gBST-2細(xì)胞系能穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)gBST-2蛋白,gBST-2蛋白能夠限制PPRV的增殖。研究結(jié)果為探究PPRV的致病機(jī)制以及宿主對(duì)抗病毒感染天然免疫提供了平臺(tái)。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

PPRV 基因組全長(zhǎng)為 15948nt[15]，在麻疹病毒屬中基因組是最長(zhǎng)的，并且 PPRV基因組滿足六堿基原則，這保證了病毒基因組的復(fù)制效率[16]。PPRV 基因組包含 6 個(gè)基因，它們按序排列分別為 3’-N、P、M、F、H、L-5’，分別編碼出 6 個(gè)蛋白，依次是核衣殼蛋白（Nucleoprotein, N）、磷蛋白（Phosphoprotein, P）、基質(zhì)蛋白（Matrix proteiM）、融合蛋白（Fusion glycoprotein, F）、血凝蛋白（Haemagglutinin glycoprotein, H）和大蛋白（ Large protein, L）[17]。P 基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，mRNA 進(jìn)行編輯，編碼產(chǎn)生P 蛋白以及兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 C 蛋白和 V 蛋白。圖 1-1 PPRV 病毒粒子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1-1 The schematic diagram of Peste despetits ruminants virusFig.1-2 Electron microscope of Peste des petits ruminantsvirus nucloapsid in the cytoplasm of an infected cell圖 1-2 被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中 PPRV 核衣殼電鏡圖

PPRV 基因組全長(zhǎng)為 15948nt[15]，在麻疹病毒屬中基因組是最長(zhǎng)的，并且 P組滿足六堿基原則，這保證了病毒基因組的復(fù)制效率[16]。PPRV 基因組包含 Fig.1-1 The schematic diagram of Peste despetits ruminants virusFig.1-2 Electron microscope of Peste des petits ruminanvirus nucloapsid in the cytoplasm of an infected cell

和 pLOV-GFP-3×Flag 載體分別用 Not I 和 Nhe I 雙酶切后過(guò)夜的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞中，菌 陽(yáng)性質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng) Not I 和 Nhe I 酶切鑒定正確（圖-2 基因序列比對(duì)一致，表明重組質(zhì)粒 pLOV-gBST-2 構(gòu)建M 1M 1 2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王萍;田玉科;田學(xué)愎;程秋菊;陳莎莎;宋珂;羅婷;;慢病毒對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J];中華麻醉學(xué)雜志;2009年05期

本文編號(hào)：2825764