發(fā)布時間：2020-09-17 20:02

　　 天然免疫系統(tǒng)的作用機制是依靠模式識別受體(PRRs)對病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)進行識別,從而在病原體識別和保護性免疫應答啟動中發(fā)揮關(guān)鍵作用,有助于宿主防御微生物感染。核酸分子包括RNA和DNA是非常重要的PAMPs,對病毒而言更是如此。RNA病毒對人類和動物健康構(gòu)成嚴峻的挑戰(zhàn),因此了解RNA受體的免疫生物學對于控制病毒感染至關(guān)重要。RNA受體由TLR3,TLR7,TLR8,RIG-I,MDA5,NLRP3,NOD2和其他少數(shù)PRRs組成。本研究主要聚焦雙鏈RNA(dsRNA)識別受體豬TLR3(pTLR3),克隆表達pTLR3,鑒定其信號功能;構(gòu)建pTLR3-NF-κB信號報告細胞系,并用于非洲豬瘟病毒(ASFV)調(diào)控蛋白的篩選;重點研究pTLR3和另外dsRNA主要識別受體pRIG-I、pMDA5之間的信號功能關(guān)系;最后制備pTLR3單克隆抗體用于下游研究。主要研究內(nèi)容如下:1.豬TLR3基因的克隆、表達和信號功能鑒定從豬的肺泡巨噬細胞中提取總RNA并使用RT-PCR對豬TLR3基因(pTLR3)進行擴增,,對得到的PCR產(chǎn)物進行純化后使用SalI和Sma I進行雙酶切處理,將酶切產(chǎn)物連接到使用Sal I和及EcoR V進行雙酶切的pENTR4-MCS-2HA載體上,構(gòu)建了中間質(zhì)粒pENTR4-pTLR3-2HA,序列分析發(fā)現(xiàn)豬TLR3開放讀碼框全長為2737 bp。利用LR位點特異性重組將pTLR3轉(zhuǎn)移到pDEST47載體中,構(gòu)建含有豬TLR3的真核表達質(zhì)粒pcDNA pTLR3。將pcDNA pTLR3質(zhì)粒對HEK293T細胞進行轉(zhuǎn)染并使用Western blotting驗證pTLR3是否正確表達。ISRE啟動子熒光素酶報告試驗中,豬TLR3能夠顯著地介導配體dsRNA類似物HMW polyI:C刺激引起的下游轉(zhuǎn)錄因子IRF3活化,表明pTLR3具有信號功能。2.豬TLR3-NF-KB信號穩(wěn)定報告細胞系的構(gòu)建及非洲豬瘟病毒(ASFV)多基因家族(MGF)蛋白的調(diào)控作用篩選用實驗室已有的293-NF-κB雙熒光素酶信號報告細胞系轉(zhuǎn)染pcDNA pTLR3,構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達pTLR3的pTLR3-293-NF-κB信號報告細胞系。該穩(wěn)定細胞系能夠?qū)sRNA類似物HMW polyI:C刺激產(chǎn)生高效、特異和穩(wěn)定的應答,因此將這個細胞系用于TLR3-NF-KB信號通路調(diào)控因子的篩選。上述pTLR3-NF-κB和實驗室已有的人TLR3/RIG-I-ISRE信號報告細胞系同時用來篩選非洲豬瘟病毒(ASFV)基因產(chǎn)物的信號調(diào)控作用。ASFV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染報告細胞、不同刺激劑刺激轉(zhuǎn)染報告細胞,應用雙熒光素酶(Luciferase)檢測試劑檢測下游信號并篩選非洲豬瘟病毒基因的調(diào)控作用。結(jié)果表明,ASFV多基因家族(MGF)調(diào)控蛋白12L,13L,UK,A276R,A528R能夠抑制 pTLR3-NF-KB 和 TLR3-ISRE 細胞信號通路;12L 和 UK 對 RIG-I/MDA5-ISRE 信號有抑制作用;這些ASFV蛋白對IFN-ISRE信號沒有顯著影響。ASFV結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白P30,P54 能顯著地抑制 pTLR3-NF-κB 活性,但是對 pTLR3-ISRE、RIG-I/MDA5-ISRE 和IFN-ISRE信號沒有顯著影響。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)P30,P54的細胞毒性非常明顯。P54是ASFV內(nèi)膜蛋白,細胞凋亡功能已經(jīng)報道,P30的細胞毒性作用還沒有報道,值得進一步研究。3.豬TLR3與MDA5、RIG-I的免疫信號功能相互關(guān)系研究利用CRISPR-CAS9技術(shù)設計pTLR3的gRNA,構(gòu)建gRNA表達慢病毒,慢病毒感染PAM和PK15。使用嘌呤霉素對pTLR3基因敲除穩(wěn)定細胞進行了篩選,并同樣獲得了pTLR3 KO PAM 和 pTLR3 KO PK15 細胞,上述細胞分別用 HMW/LMW polyI:C、EMCV、VSV、SeV刺激并檢測下游基因表達。定量RT-PCR結(jié)果表明TLR3敲除能增強LMWpolyI:C、EMCV、VSV、SeV刺激RIG-I/MDA5下游基因的表達,提示pTLR3信號能抑制pRIG-I/MDA5信號。同時利用我們實驗室之前構(gòu)建的pRIG-I KO和MDA5 KOPAM/PK15細胞,HMW polyI:C刺激TLR3下游基因表達都減弱,提示RIG-I和MDA5都能增強TLR3的信號。另一方面,將不同濃度的pTLR3分別和pRIG-I、pMDA5共轉(zhuǎn)染293T細胞,定量RT-PCR和ELAM啟動子報告基因試驗結(jié)果表明pTLR3能抑制RIG-I和MDA5下游的基因表達和NF-κB活性。反之,將不同濃度的pRIG-I、pMDA5分別和pTLR3共轉(zhuǎn)染293T細胞,結(jié)果表明pRIG-I和pMDA5都能增強pTLR3下游的基因表達和ISRE啟動子活性。MAVS是RIG-I和MDA5下游的信號接頭蛋白,不同濃度的pMAVS和pTLR3共轉(zhuǎn)染293T細胞,也能增強pTLR3下游的ISRE啟動子活性。這些結(jié)果與PAM和PK15基因敲除細胞上實驗結(jié)果相一致。在此基礎(chǔ)上,進一步分析pTLR3、pRIG-I、pMDA5分子結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渌肿有盘柕挠绊�。分別構(gòu)建 pTLR3 胞外區(qū)(pTLR3 ECD)、缺失胞外區(qū)(pTLR3 △ECD),pRIG-I/MDA52CARDs 缺失區(qū)(pRIG-I△2CARDs、pMDA5△2CARDs)的 pcDNA 真核表達質(zhì)粒。將不同濃度的 pTLR3 ECD、pTLR3 △ECD 分別和 pRIG-I/MDA5 共轉(zhuǎn)染 293T 細胞,RT-qPCR和ELAM啟動子實驗結(jié)果表明pTLR3 ECD能夠抑制pRIG-I和pMDA5下游的基因表達和NF-κB啟動子活性。反之,將不同濃度的pRIG-I2CARDs、pRIG-I△2CARDs、pMDA52CARDs、pMDA5 △2CARDs 分別和 pTLR3 共轉(zhuǎn)染 293T 細胞,RT-qPCR 和 ISRE 啟動子試驗結(jié)果表明pRIG-I 2CARDs和pMDA5 2CARD都能增強pTLR3下游基因表達和ISRE啟動子活性。以上結(jié)果表明pTLR3全長及其ECD能夠抑制pRIG-I/pMDA5下游基因表達和NF-κB活性,但pTLR3 △ECD對pRIG-I/pMDA5信號的影響不規(guī)律。pRIG-I和pMDA5全長及其2CARDs能增強pTLR3下游基因表達和ISRE活性,而pRIG-I △2CARDs和pMDA5△2CARDs對TLR3活性的影響沒有規(guī)律。4.豬TLR3單克隆抗體的制備將pENTR4-pTLR3中間質(zhì)粒LR位點特異重組到pDest527-cDNA載體中,構(gòu)建含有pTLR3的原核表達質(zhì)粒。經(jīng)誘導表達,并確定包涵體表達量最高時的IPTG誘導濃度為1mM、溫度為37℃、時間2h。在此條件下進行大量搖菌并進行蛋白純化,純化蛋白免疫BALB/c小鼠,獲取脾細胞并與骨髓瘤細胞進行融合,使用有限稀釋法對ELISA 陽性雜交瘤細胞做三次稀釋處理,最終獲得可以穩(wěn)定分泌pTLR3特異性抗體的細胞株,效價可達1:102400。該抗體在Western-blotting中可以特異識別內(nèi)源性蛋白。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

２ｋｂＢ＾Ｈ逡逑圖１－１豬ＴＬＲ３基因的ＰＣＲ擴增邐圖１－２重組質(zhì)粒ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３酶切鑒定逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＴＬＲ３邋ｇｅｎｅ邐Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邐Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ逡逑１，２，邋３，邋４：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＴＬＲ３邐１，２：邋Ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＴＬＲ３邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｓａｌ邋Ｉ邋ａｎｄ邋Ｓｍａ邋Ｉ逡逑２．２重組質(zhì)粒ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３－２ＨＡ的構(gòu)建逡逑ｐＴＬＲ３邋ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)純化后進行制Ｉ邋ａｎｄ邋Ｉ雙酶切，同時中間載體ｐＥＮＴＲ４－２ＨＡ逡逑用５Ｗ邋Ｉ邋ａｎｄ及Ｖ雙酶切。酶切產(chǎn)物膠回收的ｐＴＬＲ３與穿梭載體ｐＥＮＴＲ４－２ＨＡ連接，逡逑構(gòu)建重組中間質(zhì)粒ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３－２ＨＡ。挑取單個菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒逡逑定（５＞？0１和５ＷＩ邋），酶切ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３的條帶大�。担保耄�，符合預期（如圖１－２）；逡逑測序結(jié)果也表明中間質(zhì)粒構(gòu)建成功。逡逑２．３邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋鑒定邋ｐＴＬＲ３邋的表達逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ結(jié)果表明，抗ＨＡ抗體能夠識別＆１２０ＫＤ位置的特異性的條帶，而空

Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐＴＬＲ３邋ｉｎ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋２９３Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑質(zhì)結(jié)構(gòu)域預測逡逑站中Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ的ＣＤ－ｓｅａｒｃｈ在線應用預測豬ＴＬＲ３具有典型的ＴＬＲ結(jié)構(gòu)域特征，分別由Ｎ端的含有２２ＬＲＲＣＴ、跨膜區(qū)以及胞質(zhì)ＴＩＲ結(jié)構(gòu)域組成（圖１－４）。逡逑５００邐１０００邐１５００邐２０００邐２５００Ｉ邋Ｉ邋！邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｆｆＨｔｉＭａｉａａａｉａＢＨｉａＢＢＢａｉＢＭｉＢｉｉｉａａｉｉｉｉｉｉａＢｉＢａａａｉＨＭＨｌ？ｗｃｉｎ？－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ邋＜：邐一）邋ｌｗｃｉｎｅ寸ｉｃｈ邐ｋ？ｃｉｎ？－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ逡逑ａｔ邋0邐ｌｃｕｃｉｈ？－ｒｉｃｈ邐ｋｕｃｉｎｃ－ｒｉｃｈ邋ｒ４ｐＭｉ0邋ｌｅｕｃｉｎ？＿ｒｉｃｈ邋ｒ＾ｐＭｔＯ逡逑ｒ？ｐ？ｆｌｉ0邋ｌ？？ｃｉｎ？－ｐｉｃｈ邐ｌ？ｗｃｉｎ＊寸ｉｃｈ邋ｒｔｔｐＭｔ邋0逡逑ｃｈ邋ｒ？ｐｃ＜ｉｉＣＪ邋ｌ？？ｃｉｈｅ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ＾１）邋ｌｅｕｃｉｔｔｔ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ逡逑ｅ－ｒｉｃｈ邐ｌ？ｕｃｉｎ？－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ邋0邋ｌｅｕｃｉｎ？－ｒｉｃｈ逡逑ｃｉｈ４－ｒｉｃｈ邐？＞邐Ｕｗｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ逡逑ｌｗｃｉｎｔ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ邐ｌ？？ｃｉｎｔ－ｒｉｃｈ邋ｒ？ｐｅａｉ＜＾逡逑ｋｕｃｉｒｉｆｔ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｗｔ＾逡逑x5：ｍ彳邐ｔｉｒｊ邋：＾ＩＰＫＲ．Ｃ２ｉ逡逑

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本文編號：2821163