重樓皂苷Ⅰ(polyphyllinⅠ,PPⅠ)是從中藥重樓中提取的一種小分子單體,屬于甾體皂苷。PPⅠ作為一種毒副作用小且具有強(qiáng)烈抗腫瘤效應(yīng)的小分子物質(zhì),已經(jīng)被報(bào)道能影響多種腫瘤細(xì)胞和移植瘤的生長(zhǎng)。肝癌在世界常見(jiàn)惡性腫瘤中位列第五,患者生存期短。近些年來(lái),世界各地肝癌患者人數(shù)劇增,該病已成為威脅人類(lèi)健康的重大疾病之一。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn),重樓皂苷Ⅰ能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的死亡并誘導(dǎo)其凋亡,線(xiàn)粒體通路的激活是其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制,但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)和死亡受體(death receptor,DR)信號(hào)通路在這一過(guò)程中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究應(yīng)用CCK-8法、Hochst33258染色、qRT-PCR(real-time quantitative PCR)、免疫印跡(Western blot,WB)等技術(shù)和方法,從表觀(guān)水平、基因水平和蛋白水平深入研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和死亡受體通路在PPⅠ誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡中的作用,為尋找重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的效應(yīng)蛋白提供研究方向及理論基礎(chǔ),并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行新的治療靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.重樓皂苷Ⅰ對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響重樓皂苷Ⅰ對(duì)HepG2細(xì)胞存活率和細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的影響采用CCK-8法和Hoechst33258染色法進(jìn)行檢測(cè);免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2的變化水平。試驗(yàn)表明:(1)重樓皂苷Ⅰ呈時(shí)間 濃度依賴(lài)的方式抑制HepG2細(xì)胞的存活率。PPⅠ刺激HepG2細(xì)胞6、12和24 h的ⅠC50分別為4.4±0.5μmol/L、2.5±0.1μmol/L和2.3±0.2μmol/L。(2)重樓皂苷Ⅰ刺激HepG2細(xì)胞12 h后,經(jīng)Hoechst33258染色及熒光顯微鏡可觀(guān)察到細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的凋亡細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞體積縮小、核固縮,細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)濃染的藍(lán)色顆粒狀強(qiáng)熒光,且細(xì)胞內(nèi)的濃染顆粒與重樓皂苷Ⅰ的使用濃度呈正比關(guān)系。(3)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)促凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3和Bax表達(dá)顯著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明,重樓皂苷Ⅰ抑制HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.重樓皂苷Ⅰ對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的影響為了進(jìn)一步研究重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路相關(guān),采用qRT-PCR法檢測(cè)HepG2細(xì)胞中GRP78、ATF-6、PERK、ⅠRE-1和CHOP mRNA的表達(dá)情況;免疫印跡法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Cleaved-caspase12、Caspase-12、ⅠRE-1和CHOP的變化;隨后用20 mmol/L內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-苯基丁酸(4-pHenyl butyric acid,4-PBA)預(yù)處理HepG2細(xì)胞2 h,檢測(cè)ⅠRE-1蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞核形態(tài)學(xué)及細(xì)胞凋亡率的變化,確定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在PPⅠ誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡中的作用。結(jié)果顯示:(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)基因中,ATF-6和PERK mRNA水平無(wú)明顯變化,GRP78和ⅠRE-1 mRNA水平均顯著升高,提示重樓皂苷Ⅰ可能特異性的激活了ⅠRE-1通路;在蛋白水平發(fā)現(xiàn)PPⅠ可活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白Caspase-12,同時(shí)ⅠRE-1蛋白顯著增加。(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路下游重要的促凋亡因子CHOP在mRNA水平和蛋白水平均無(wú)明顯變化。(3)4-PBA預(yù)處理HepG2細(xì)胞2 h后,細(xì)胞內(nèi)ⅠRE-1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),提示4-PBA有效的抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被抑制后,HepG2細(xì)胞中濃染的細(xì)胞核及細(xì)胞凋亡率均顯著增加。以上結(jié)果提示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的過(guò)程中被激活,但其在該過(guò)程中并沒(méi)有發(fā)揮促凋亡作用,而是細(xì)胞的一種自我保護(hù)反應(yīng)。3.重樓皂苷Ⅰ對(duì)HepG2細(xì)胞死亡受體通路的影響為了進(jìn)一步研究重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制是否與死亡受體信號(hào)通路相關(guān),采用qRT-PCR法檢測(cè)HepG2細(xì)胞中死亡受體通路相關(guān)基因Fas、FasL、TNFR1和TNF-αmRNA水平的變化;免疫印跡法檢測(cè)死亡受體通路相關(guān)蛋白Cleaved-caspase8、FADD、Fas和TNF-α的變化;隨后用Caspase-8抑制劑Z-ⅠETD-FMK及壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1(Nec-1)預(yù)處理細(xì)胞2 h,檢測(cè)細(xì)胞存活率以及壞死性凋亡蛋白R(shí)ⅠPK1和RⅠPK3的變化,確定死亡受體通路在PPⅠ誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡中的作用,以及驗(yàn)證Caspase-8的抑制是否激活了HepG2細(xì)胞的壞死性凋亡。結(jié)果顯示:(1)死亡受體通路相關(guān)基因中,Fas、FasL、TNFR1和TNF-αmRNA水平均顯著增加,提示死亡受體通路可能被激活;接下來(lái)在蛋白水平發(fā)現(xiàn)PPⅠ可活化死亡受體通路的標(biāo)志蛋白Caspase-8,同時(shí)FADD、Fas和TNF-α蛋白均顯著增加,該結(jié)果驗(yàn)證了qRT-PCR結(jié)果。(2)Z-ⅠETD-FMK預(yù)處理2 h后,觀(guān)察到HepG2細(xì)胞皺縮明顯,細(xì)胞數(shù)量也明顯減少,且壞死性凋亡相關(guān)蛋白R(shí)ⅠPK1和RⅠPK3大量表達(dá),但在各組間無(wú)顯著性變化。提示Caspase-8的抑制,可能激活了細(xì)胞內(nèi)的另一條不依賴(lài)Caspase的凋亡途徑即壞死性凋亡途徑繼續(xù)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。(3)Z-ⅠETD-FMK聯(lián)合Nec-1預(yù)處理細(xì)胞2 h后,細(xì)胞存活率較Z-ⅠETD-FMK單獨(dú)預(yù)處理組顯著升高,該結(jié)果驗(yàn)證了HepG2細(xì)胞中壞死性凋亡的發(fā)生。以上研究表明,死亡受體通路在在重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的過(guò)程中被激活,且發(fā)揮促凋亡的作用,但當(dāng)其被抑制時(shí),可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡,加強(qiáng)細(xì)胞死亡。綜上所述,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和死亡受體信號(hào)通路在重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的過(guò)程中均被激活,但該過(guò)程激活的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激適應(yīng)性系統(tǒng),抑制了HepG2細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)細(xì)胞存活,說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)HepG2細(xì)胞的死亡具有負(fù)向調(diào)控作用,這提示我們?cè)谂R床治療時(shí)將重樓皂苷Ⅰ和抑制劑聯(lián)合應(yīng)用有望提高癌細(xì)胞的死亡,從而達(dá)到最終清除癌細(xì)胞的目的;此外,死亡受體信號(hào)通路的抑制可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡,進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而加強(qiáng)細(xì)胞死亡,說(shuō)明重樓皂苷Ⅰ不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而且具有誘導(dǎo)壞死性凋亡的效應(yīng),提示重樓皂苷Ⅰ有望成為一種有效的抗癌藥物應(yīng)用于臨床。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S853.74
【部分圖文】：

圖 1-1 重樓皂苷的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 The structure of the polyphyllins注：A：重樓皂苷Ⅰ；B：重樓皂苷Ⅱ；C：重樓皂苷Ⅵ；D：重樓皂苷Ⅶ。Note: A: polyphyllin Ⅰ; B: polyphyllin Ⅱ; C: polyphyllin Ⅵ; D: polyphyllin Ⅶ樓皂苷的抗腫瘤活性樓皂苷具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其作為云南白藥、 宮血寧等中成藥應(yīng)用于臨床多年[14]。近年來(lái)，重樓皂苷的抗腫瘤作用備受關(guān)注，作藥，已用于多種癌癥的治療，為治療癌癥提供了新的策略。重樓皂開(kāi)發(fā)治療癌癥的藥物多為中藥組方，包括益肺抗瘤飲、清毒飲、抗煎劑等。雖然作用機(jī)理不同，但均有良好的抗癌效果，在臨床治療。機(jī)體外周血中 NK 細(xì)胞，抗原 CD3 和 CD4 的抗體與機(jī)體的免疫高他們的活性或含量，便能提高機(jī)體免疫力，調(diào)動(dòng)患者本身的抗腫

< 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究直方圖采用 GraphPad 果苷 I 對(duì)肝癌 HepG2 細(xì)胞存活率及凋亡的影響皂苷 I 對(duì)肝癌 HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用度重樓皂苷 I 分別處理 HepG2 細(xì)胞 6、12 和 24 h，采用 C。結(jié)果顯示，重樓皂苷 I 處理可以不同程度的抑制 HepG2 細(xì)的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。根據(jù) GrapHpad prism 5 軟件計(jì)算出重胞 6、12 和 24 h 的 IC50分別為 4.4 ±0.5 μmol/L、2.5 ±0.1 μ（圖 3-1）�；谝陨辖Y(jié)果, 本研究選擇 2.5 μmol/L 和 12 h 作苷 I 的作用濃度和時(shí)間。

18圖 3-2 重樓皂苷Ⅰ對(duì) HepG2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig. 3-2 The effect of PPI on morpHology of HepG2 cells3.1.2 重樓皂苷 I 對(duì) HepG2 細(xì)胞核形態(tài)的影響為明確重樓皂苷 I 誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞死亡的類(lèi)型，試驗(yàn)采用 Hoechst 33258 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。重樓皂苷 I （1、2、3、4 和 5 μmol/L）作用 12 h 后可見(jiàn) HepG2 細(xì)胞表現(xiàn)出典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)，其中細(xì)胞核被著色為藍(lán)色強(qiáng)熒光是最重要的標(biāo)志，且濃染的細(xì)胞數(shù)及熒光強(qiáng)度與重樓皂苷 I 的使用濃度呈正比關(guān)系。而陰性對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)明顯的核固縮或濃染現(xiàn)象，細(xì)胞著色為彌散性均勻熒光，且熒光強(qiáng)度較弱。參照文獻(xiàn)[92]隨機(jī)計(jì)數(shù) 5 個(gè)視野中的致密濃染細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。陰性對(duì)照組和試驗(yàn)組的凋亡率分別是：3.0%（0 μmol/L）、7.3%（1μmol/L）、13.3%（2 μmol/L）、15.2%（3 μmol/L）、23.7%（4 μmol/L）和 61.6%（5 μmol/L），隨著處理濃度的升高，試驗(yàn)組凋亡率顯著性上調(diào)（P < 0.01, 圖 3-3）。

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