小鵝瘟是一種高發(fā)病率和高死亡率的傳染病,給我國養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大危害。目前小鵝瘟病尚無有效的治療藥物,主要依靠卵黃抗體(Immunoglobulin of yolk,IgY)和高免血清等進(jìn)行防治,所以新型藥物的研制具有重要意義。干擾素(IFN)是體內(nèi)一種重要的干擾病毒繁殖的免疫活性細(xì)胞因子,主要由病毒、噬菌體及人工合成核苷酸(如聚肌胞)誘生,具有廣譜的抗病毒活性,對多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用,還具有抗增殖,抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)的功能。本研究將鵝干擾素α(goIFNα)克隆至大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達(dá)載體pSIP409-pgsA’中,并將其電轉(zhuǎn)化至植物乳桿菌NC8中獲得具有抗病毒效果的新功能型乳酸菌,本研究對制備抗病毒新型微生態(tài)制劑防治小鵝瘟病以及確保動(dòng)物的生產(chǎn)安全與食品安全具有重要意義。具體研究方案與結(jié)果如下:根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子對GenBank上已發(fā)表的鵝IFNα序列基因進(jìn)行優(yōu)化,通過生物公司合成后,將goIFNα片段與原核表達(dá)載體pET28-a連接,成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET28-a-goIFNα,并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot檢測。SDS-PAGE和Western-blot的鑒定結(jié)果表明,goIFNα蛋白分子量大小在18kd左右,與預(yù)期大小相同,同時(shí)具有良好的反應(yīng)原性。通過切膠回收的方法將目的條帶回收,將蛋白膠碾碎后與PBS混合后,將其打入小鼠體內(nèi),15天后回收血清。Western-blot的鑒定結(jié)果表明成功制作鼠抗goIFNα血清。根據(jù)GenBank上已公布的鵝IFNα序列在其完整的開放閱讀框上下游設(shè)計(jì)上、下游引物,并分別在上游引物和下游引物中加入XbaⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。以質(zhì)粒pMD18-T-goIFNα為模板PCR擴(kuò)增,獲得goIFNα基因片段并與大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達(dá)載體pSIP409-pgsA’連接,構(gòu)建穿梭表達(dá)質(zhì)粒pSIP409-pgsA’-goIFNα。經(jīng)電轉(zhuǎn)化至植物乳桿菌NC8中,構(gòu)建新功能型乳酸菌NC8-pSIP409-pgsA’-goIFNα(以下縮寫為pp-goIFNα/NC8)。提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR、雙酶切驗(yàn)證,并將質(zhì)粒測序。驗(yàn)證結(jié)果均證明成功構(gòu)建新功能型乳酸菌。新功能型乳酸菌經(jīng)清酒乳桿菌素sakasin-P(SppIP)誘導(dǎo)后超聲破碎和反復(fù)凍融,經(jīng)Western-blot分析,結(jié)果表明新功能型乳酸菌已表達(dá)goIFNα蛋白,通過免疫熒光試驗(yàn)也證明了goIFNα錨定表達(dá)在菌體表面具有良好的反應(yīng)原性。通過鵝胚成纖維細(xì)胞(GEF)對新功能型乳酸菌的抗病毒效果進(jìn)行體外檢測。首先測定不同濃度(10:1、80:1、160:1)的新功能型乳酸菌的抗病毒效果,新功能型乳酸菌與細(xì)胞之間濃度比為80:1時(shí)抗病毒效果最佳。隨后將新功能型乳酸菌以80:1的比例孵育細(xì)胞,設(shè)置DMEM空白對照,GPV對照,干擾素蛋白對照,NC8空載體(NC8pSIP409-pgsA’,pp/NC8)組,pp-goIFNα/NC8+GPV組(即先加入新功能型乳酸菌pp-goIFNα/NC8后加入小鵝瘟病毒GPV),GPV+pp-goIFNα/NC8組(即先加入小鵝瘟病毒GPV后加入新功能型乳酸菌pp-goIFNα/NC8)。結(jié)果顯示,與空載體組相比,pp-goIFNα/NC8+GPV組、GPV+pp-goIFNα/NC8組以及蛋白組均有良好的抗病毒作用。除此之外我們還測定了細(xì)胞抗病毒因子goIFNα和goIFN-β以及干擾素刺激因子MX、OAS和PKR基因的相對表達(dá)量,結(jié)果顯示,與空載體組相比,pp-goIFNα/NC8+GPV組、GPV+pp-goIFNα/NC8組以及蛋白均能夠上調(diào)GEF的goIFNα和goIFN-β基因表達(dá)水平,由此上調(diào)細(xì)胞內(nèi)干擾素刺激基因(ISG)的mRNA水平,保護(hù)細(xì)胞不受小鵝瘟病毒的感染。將新功能型乳酸菌在3日齡雛鵝連續(xù)口服3天,第4天對雛鵝攻毒,同時(shí)記錄體重,計(jì)算體重變化率和生存情況。免疫結(jié)束后取組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。取血清測定抗病毒因子IFNα和IFN-β在外周血中的水平,取脾臟檢測組織中細(xì)胞抗病毒因子goIFNα和goIFN-β以及干擾素刺激因子MX、OAS和PKR基因的基因表達(dá)量。取肝臟、心臟、脾臟和腸道制作病理切片觀察組織病理學(xué)變化。結(jié)果顯示,攻毒后Normal組、GPV組、pp/NC8+GPV組、pp-goIFNα/NC8+GPV組、GPV+pp-goIFNα/NC8組以及IgY組雛鵝的存活率分別為100%,30%,40%,50%,70%和40%。提取脾臟中病毒DNA和總RNA后檢測,結(jié)果顯示,與對照組相比,新功能型乳酸菌pp/NC8-goIFNα可以顯著降低GPV的DNA基因表達(dá)量,提升雛鵝脾臟中IFNα和IFN-β基因表達(dá)水平,由此上調(diào)各種抗病毒細(xì)胞因子如MX、OAS、PKR等。通過肝臟、心臟、脾臟和小腸的組織病理切片可觀察到,GPV組雛鵝組織病理學(xué)變化最嚴(yán)重,pp-goIFNα/NC8+GPV組、GPV+pp-goIFNα/NC8組以及IgY組雛鵝未見明顯組織病理學(xué)變化。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功制備鼠抗goIFNα血清,成功構(gòu)建新功能型乳酸菌pp-goIFNα/NC8,并成功將goIFNα蛋白錨定在乳酸菌表面,結(jié)果顯示新功能型乳酸菌能夠降低組織病理損傷和炎性病變,降低體內(nèi)病毒的復(fù)制,增加了機(jī)體的抗病毒效果,為研制治療小鵝瘟病的生物制品具有重要意義。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.33
【部分圖文】：

圖 1.1 goIFN-α 基因 PCR 擴(kuò)增M. DL-2 000 Marker. 1. PCR 擴(kuò)sult of PCR amplification produc2 000 Marker. 1.Amplification p50007505002501002000150010003000M 1bp

8-a-IFNα 的構(gòu)建圖 1.2 克隆質(zhì)粒 pMD19T-goIFN-α L-5 000 Marker. 1,2. NdeⅠ+ XhoⅠ enzyme digestion analysis of the clon0 Marker. 1,2. NdeⅠ+ XhoⅠ double dig

白的 Western-blot 分析圖 1.4 goIFN-α 蛋白的 Western-blot 檢測M. 蛋白質(zhì) Marker. 1. pET28-a/BL21 對照. 2-9.蛋白 goIFN-αFig.1.4 Western-blot analysis of goIFN-α proteinM. Protein Marker. 1. pET28-a/BL21 control. 2-9. goIFN-α protein0

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 范娟;錢鐘;劉秀梵;;一株小鵝瘟病毒的生物學(xué)特性分析[J];中國家禽;2017年07期

2 朱少璇;董國雄;;抗小鵝瘟病毒單克隆抗體及其在防治上的初步應(yīng)用[J];江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);1989年03期

3 陳少鶯;程曉霞;陳仕龍;王劭;林鋒強(qiáng);吳南洋;俞伏松;莊曉東;朱小麗;王錦祥;程由銓;;半番鴨新型小鵝瘟病毒病研究簡報(bào)[J];福建農(nóng)業(yè)科技;2015年07期

4 韋麗敏;吳華俊;朱寅彪;陳素娟;;一株小鵝瘟病毒的分離與鑒定[J];中國家禽;2013年05期

5 金明蘭;;一起小鵝瘟病毒與鏈球菌混合感染的診治[J];養(yǎng)殖技術(shù)顧問;2010年06期

6 方英,劉栩,付貴興,杜麗娟,陳云秀;小鵝瘟病毒的分離鑒定[J];中國獸醫(yī)科技;2002年07期

7 徐為燕;周陽生;;小鵝瘟病毒反向間接血球凝集試驗(yàn)的初步報(bào)告[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);1981年01期

8 灻一忠;曹永萍;;1株小鵝瘟病毒的分離及鑒定[J];畜牧與獸醫(yī);2013年10期

9 葛凱;王桂軍;李培英;夏倫斌;陳習(xí)中;左瑞華;;小鵝瘟病毒蛋白質(zhì)的研究概況[J];山東畜牧獸醫(yī);2010年12期

10 龔建森;劉幀亞;黃永良;單艷菊;張小燕;施祖灝;朱云芬;葛慶聯(lián);陸俊賢;劉學(xué)賢;;雙抗夾心ELISA檢測小鵝瘟病毒的研究[J];湖北畜牧獸醫(yī);2008年10期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 程曉霞;肖世峰;陳仕龍;朱小麗;林鋒強(qiáng);王劭;俞博;王錦祥;吳南洋;黃梅清;鄭敏;陳少鶯;俞伏松;;短嘴型小鵝瘟病毒傳播途徑研究[A];福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2016年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2016年

2 宋娜;石亞運(yùn);郭卉;涂飛;邵紅霞;金文杰;錢琨;秦愛建;;一株高效價(jià)抗小鵝瘟病毒中和性單克隆抗體[A];第四屆全國禽病分子生物技術(shù)青年工作者會(huì)議論文集[C];2015年

3 肖世峰;程曉霞;陳仕龍;林鋒強(qiáng);朱小麗;王劭;俞博;吳南洋;黃梅清;鄭敏;王錦祥;陳少鶯;俞伏松;;短嘴型小鵝瘟病毒對櫻桃谷鴨的致病性研究[A];福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2016年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2016年

4 曹宗喜;林哲敏;張艷;邢漫萍;葉保國;;小鵝瘟病毒海南株的分離鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2014年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2014年

5 盧菲;程安春;汪銘書;韓新鋒;黎敏;車茜;劉曉東;陳孝躍;;不同劑量小鵝瘟病毒VP3基因疫苗基因槍轟擊誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞免疫的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第十二次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

6 盧菲;程安春;汪銘書;韓新鋒;黎敏;車茜;劉曉東;陳孝躍;;小鵝瘟病毒VP3基因疫苗與弱毒疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的比較[A];第四屆第九次全國學(xué)術(shù)研討會(huì)暨飼料和動(dòng)物源食品安全戰(zhàn)略論壇論文集（下冊）[C];2008年

7 劉曉東;汪銘書;程安春;韓新鋒;盧菲;黎敏;陳孝躍;;肌注免疫小鵝瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠體內(nèi)表達(dá)時(shí)相的研究[A];第四屆第九次全國學(xué)術(shù)研討會(huì)暨飼料和動(dòng)物源食品安全戰(zhàn)略論壇論文集（下冊）[C];2008年

8 劉曉東;汪銘書;程安春;韓新鋒;盧菲;黎敏;陳孝躍;;肌注和基因槍轟擊小鵝瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠體內(nèi)表達(dá)時(shí)相的比較研究[A];第四屆第九次全國學(xué)術(shù)研討會(huì)暨飼料和動(dòng)物源食品安全戰(zhàn)略論壇論文集（下冊）[C];2008年

9 盧菲;程安春;汪銘書;韓新鋒;黎敏;車茜;劉曉東;陳孝躍;;基因槍轟擊和肌肉注射小鵝瘟病毒VP3基因疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫發(fā)生的比較研究[A];第四屆第九次全國學(xué)術(shù)研討會(huì)暨飼料和動(dòng)物源食品安全戰(zhàn)略論壇論文集（下冊）[C];2008年

10 李書光;王金良;王艷;劉吉山;苗立中;沈志強(qiáng);;山東省小鵝瘟病毒BZ株的分離鑒定及VP3基因的序列分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 董以愛 吳紅波;春季養(yǎng)鵝防鵝瘟[N];中國畜牧報(bào);2002年

2 李澤相;怎樣防治鵝常見病[N];廣東科技報(bào);2001年

3 江濤;鵝常見病咋防治[N];山西科技報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 李書光;小鵝瘟病毒保護(hù)性抗原的原核表達(dá)及免疫原性研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 楊金龍;小鵝瘟強(qiáng)毒在人工感染雛鵝體內(nèi)侵染規(guī)律及對消化道菌群結(jié)構(gòu)影響的分子解析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 周游;表面展示鵝干擾素α新功能型乳酸菌的構(gòu)建及抗小鵝瘟病毒效果研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

2 于浩然;復(fù)方中草藥對患小鵝瘟病毒雛鵝的療效觀察[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 黃冠雄;2015-2016年廣東省小鵝瘟病毒分子流行病學(xué)調(diào)查[D];仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院;2017年

4 關(guān)志偉;廣東小鵝瘟病毒血清學(xué)調(diào)查及VP3特異抗原片段的高效表達(dá)[D];仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院;2017年

5 王暖成;小鵝瘟病毒延邊株VP3基因的原核表達(dá)及免疫性分析[D];延邊大學(xué);2010年

6 呂亞楠;小鵝瘟病毒PCR檢測方法的建立及江淮地區(qū)小鵝瘟病毒分子流行病學(xué)調(diào)查[D];揚(yáng)州大學(xué);2014年

7 郇長超;小鵝瘟病毒W(wǎng)H-12株的分離鑒定及其雙抗夾心ELISA檢測方法的建立[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 武世珍;濰坊地區(qū)小鵝瘟流行現(xiàn)狀調(diào)查和防制的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 櫻桃;GPV感染鵝免疫組織中病毒的檢測及免疫抑制的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

10 鹿鐘文;小鵝瘟病毒VP3基因的克隆表達(dá)及抗小鵝瘟病毒單克隆抗體的研制[D];揚(yáng)州大學(xué);2012年

本文編號：2814621