【摘要】：鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一種侵害雛鴨、鵝等禽類的急性或慢性傳染病,以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為主要臨床特征。目前RA在國內流行血清型主要為1、2、10型,各血清型之間缺少有效交叉免疫保護性,幾乎所有血清型只與同源抗血清發(fā)生特異性反應且RA各血清型之間的抗原結構存在較大差異。臨床上常用實驗室方法如ELISA、PCR進行診斷,但這些方法耗時長,需要專業(yè)的技術人員。本研究基于抗OmpA/motb蛋白的兔多克隆抗體和RA單克隆抗體,建立一種適用于臨床的快速、簡便的檢測RA血清1、2、10型的方法。1鴨疫里默氏桿菌OmpA/motb的表達及多克隆抗體的制備以RA CH3基因組DNA為模板,PCR擴增ompA/motb基因,構建出表達載體pET30a-OmpA/motb,將質粒pET30a-OmpA/motb轉化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株中,經IPTG誘導表達重組蛋白OmpA/motb。Western blot結果顯示,rOmpA/motb能與血清1、2、10型RA陽性血清發(fā)生特異性反應。以純化的rOmpA/motb免疫新西蘭大白兔,經三次免疫后兔血清中抗OmpA/motb蛋白的抗體效價為1:256,000,Western blot結果顯示OmpA/motb兔多抗可與血清1型、2型、10型RA菌株發(fā)生特異性結合反應,與其他菌株無反應性。2鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體的制備前期研究中,我們篩選到1株具有血清1、2和10型交叉免疫原性的RA脂多糖突變株RA1062。本研究以RA脂多糖突變株RA1062免疫BALB/c小鼠,細胞融合后分別以血清1、2、10型RA菌株(CH3、NJ3、HXb2)作為包被抗原,篩選出能穩(wěn)定分泌抗血清1、2、10型RA菌株的單克隆抗體雜交瘤細胞株。通過體內誘生腹水法制備抗體,并分析獲得的腹水單抗特性。本次共獲得3株RA單克隆抗體,分別命名為2C2、2D9和3E3,3株單抗亞類鑒定均為IgM。ELISA結果表明,2C2、2D9和3E3腹水效價依次分別為1:64,000,1:128,000,1:64,000。Western blot結果顯示,3株單抗均能與血清1、2和10型RA菌株(CH3、NJ3、Hxb2)發(fā)生特異性反應,與其他禽源致病菌不發(fā)生反應,表明獲得的單克隆抗體具有良好的血清型交叉反應性及種屬特異性。3鴨疫里默氏桿菌免疫膠體金快速檢測技術研究應用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,標記上述制備的單克隆抗體(2C2、2D9、3E3、抗OmpA/motb兔血清)。通過對膠體金稀釋液、NC膜、金標墊等優(yōu)化,確定了以單抗3E3標記膠體金顆粒,以單抗2C2作為檢測線,以羊抗鼠IgG作為質控線,制備了RA快速檢測試紙條。該試紙條能夠檢測出鴨疫里默氏桿菌血清1、2、10型菌株,但對于禽致病性大腸桿菌、沙門氏菌及巴氏桿菌不發(fā)生反應。該試紙條最低能夠檢測出2.5×10~6CFU/mL的鴨疫里默氏桿菌。綜上所述,基于RA LPS缺失株RA1062制備的單克隆抗體研制的金標試紙條具有良好特異性,可用于RA血清1、2、10型菌株檢測。
【學位授予單位】：安徽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4
【圖文】：

適金標抗體復合物平鋪于經封閉液處理后的金標墊上，37 ℃烘干G 稀釋至 1.5 mg/mL 作為控制線(Control line, C 線)，RA 單克隆抗g/mL、1.5 mg/mL 和 2.0 mg/mL 作為檢測線(Test line, T 線)。噴線完。取 100 μL 鴨疫里默氏桿菌 WJ4、Yb2、HXb2 菌液(2.5×109CFU液滴加至樣品墊上，觀察結果，以選擇最適的抗體反應濃度。紙條的組裝及結果判定最佳封閉液對金標墊進行處理，37 ℃烘干備用。備完成的金標抗體復合物均勻的平鋪于處理后的金標墊上，37 ℃體金噴線儀將上述確定的最適濃度的抗體噴線于 NC 膜上，待第一干后在相同的位置重復噴線一次。如圖 1 1[76]組裝試紙條。的判定：當檢測結果為陽性時可見質控線與檢測線均出現(xiàn)肉眼可見不出現(xiàn)肉眼可見的條帶，質控線出現(xiàn)或不出現(xiàn)條帶時，結果均判定示)）。

及結果判定對金標墊進行處理，37 ℃烘干備用。標抗體復合物均勻的平鋪于處理后的金標墊將上述確定的最適濃度的抗體噴線于 NC 膜的位置重復噴線一次。裝試紙條。檢測結果為陽性時可見質控線與檢測線均出可見的條帶，質控線出現(xiàn)或不出現(xiàn)條帶時，圖 1 1 膠體金免疫試紙條結構示意圖Fig.1 1 The sketch map of gold immunochromatographic str

2.1.2 重組載體 pET30a-OmpA/motb 的構建用 BamH I 和 Sal I 雙酶切目的基因片段和表達載體后，用 Ligation Mix 進行連接并轉化至DH5α中，PCR鑒定獲得2株陽性克隆，命名為pET30a-OmpA/motb(圖2 2A)。雙酶切鑒定結果表明目的片段大小與理論值一致(圖 2 2B)。測序結果表明，重組載體中的 ompA/motb 基因序列完全正確，表明成功構建了重組載體 pET30a-OmpA/motb。圖 2 2 重組載體 pET30a-OmpA/motb 的構建Fig 2 2 Construct of recombinant pET30a-OmpA/motbA.重組 pET30a-ompA 載體 PCR 鑒定; M: DL 2000 DNAMarker; 1: 陰性對照; 2~3: E.coli BL21 (DE3)菌株(含質粒 pET30a-OmpA/motb)ompA/motb 基因擴增產物; B.重組 pET30a-OmpA/motb 載體雙酶切鑒定; M: DL 10000 DNA Marker; 1: pET30a-OmpA/motb 質粒經 BamH I和 Sal I 雙酶切產物; 2: pET-30a（+）質粒經 BamH I 和 Sal I 雙酶切產物A. Identification of recombinant pET30a-ompA/motb by PCR; M: DL 2000 DNA Marker;2-3: The ompA/motb gene was amplified from E. coliBL21(DE3) which contains recombinant pET30a-OmpA/motb; 1:Negative control; B. Identification of recombinant pET30a-OmpA/motb bydual-enzyme digestion; B. M: DL 10000 DNAMarker; 1:

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張宇曦;韓先干;左佳坤;龔建森;韓月;范國博;王少輝;田明星;丁鏟;祁克宗;于圣青;;禽致病性大腸桿菌脂多糖核心型分布與毒力基因的相關性分析[J];微生物學通報;2015年08期

2 侯灣灣;韓先干;王少輝;王小蘭;岳嘉

本文編號：2804453