發(fā)布時間：2020-08-25 19:03

【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF),又名豬霍亂(Hog cholera),是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever virus,CSFV)引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病,具有高發(fā)病率、高致死性等特點,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。CSFV中的保護性抗原蛋白E0(E~(rns)),是該病毒內(nèi)唯一可分泌到感染細胞上清中的囊膜糖蛋白,也是病毒吸附進入敏感細胞的必須蛋白,因此體外生產(chǎn)CSFV E0蛋白對診斷及防制CSF具有重要意義。本實驗根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性,將CSFV E0蛋白成熟肽片段進行優(yōu)化合成,利用PCR方法從重組質(zhì)粒yE0-sys中擴增得到優(yōu)化后的CSFV E0成熟肽基因,將該片段與畢赤酵母載體pPICZαA分別雙酶切后進行連接,構(gòu)建得到重組表達質(zhì)粒pPICZαA-E0,用限制性內(nèi)切酶SacⅠ將其線性化后,電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞。經(jīng)博來霉素(Zeocin)高抗篩選后,將經(jīng)鑒定的陽性重組酵母菌進行甲醇誘導(dǎo)分泌型表達,通過將表達產(chǎn)物上清經(jīng)SDS-PAGE、Western-blot和凝膠質(zhì)譜測序分析,證實CSFV E0蛋白在畢赤酵母中成功實現(xiàn)分泌型表達;通過對最佳誘導(dǎo)時間、溶氧量、最佳甲醇誘導(dǎo)濃度等條件進行摸索優(yōu)化,得到了CSFV E0蛋白在畢赤酵母中分泌表達的最佳條件,即在28℃的誘導(dǎo)溫度下,培養(yǎng)搖瓶體積1/10的菌液,并在表達培養(yǎng)基中添加1%Tween-80,同時始終保持1%的甲醇誘導(dǎo)終濃度,誘導(dǎo)表達72h時表達量可達到峰值。按此表達條件,在比較重組酵母菌不同轉(zhuǎn)化子表達量的差異后,選用篩選得到的優(yōu)勢菌株進行表達,誘導(dǎo)分泌72h時,表達量達到25.6mg/L。經(jīng)過重復(fù)性實驗驗證,本研究構(gòu)建的重組酵母菌pPICZαA-E0-X33能夠在畢赤酵母中實現(xiàn)穩(wěn)定的分泌表達,且將表達菌液上清進行超濾濃縮后,使用鎳離子金屬親和層析柱進行純化,得到了大小約37kDa具有N-連接的糖基化CSFV E0蛋白,為監(jiān)測、診斷和防制CSF及研發(fā)有關(guān)CSFV E0蛋白的生物制品提供了物質(zhì)條件。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651

【參考文獻】

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1 傅小蒙;孔令聰;裴志花;劉樹明;馬紅霞;;畢赤酵母表達系統(tǒng)優(yōu)化策略概述[J];中國生物工程雜志;2015年10期

2 劉高磊;胡蝶;鄔敏辰;殷欣;汪俊卿;;內(nèi)切葡聚糖酶與木聚糖酶在畢赤酵母中的共分泌表達[J];食品與生物技術(shù)學(xué)報;2015年03期

3 曹東艷;韓詩雯;陳董鑫;柳倩;賀曉云;許文濤;梅曉宏;;用GAP啟動子在畢赤酵母中組成型表達重組獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑[J];食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報;2014年03期

4 趙炎蔥;李景華;趙學(xué)禮;;不同培養(yǎng)基對畢赤酵母工程菌生長的影響[J];中國醫(yī)療前沿;2013年07期

5 薛沖沖;張俊輝;林影;韓雙艷;;畢赤酵母高效表達整合有CBD的米黑根毛霉脂肪酶[J];生物技術(shù)通報;2013年02期

6 陸永超;蔣琳;;畢赤酵母高效表達策略概述[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進展;2013年01期

7 李紅亮;陳勇;陳海容;黃程;馮一建;梅翔;何躍;范開;;應(yīng)用雙啟動子共表達體系提高人胰島素原在畢赤酵母中的表達量[J];中國生物制品學(xué)雜志;2012年04期

8 張文明;洪靜;孫天瑋;黃國團;梁軍;王大力;林殿海;;長鏈人胰島素樣生長因子-1在畢赤酵母中表達條件的優(yōu)化[J];中國生物制品學(xué)雜志;2012年04期

9 湯偉;李雅華;劉露;張軍霞;咸洪泉;;重組畢赤酵母表達棘孢木霉幾丁質(zhì)酶Tachi1的酶學(xué)性質(zhì)研究及表達條件優(yōu)化[J];微生物學(xué)報;2012年03期

10 汪匯慧;金虎;高敏杰;戴科科;董世娟;于瑞嵩;李震;史仲平;;甲醇/山梨醇共混流加誘導(dǎo)改變畢赤酵母生產(chǎn)豬α干擾素過程的代謝產(chǎn)能途徑強化發(fā)酵性能[J];生物工程學(xué)報;2012年02期

本文編號：2804081