【摘要】：當病原體入侵時,機體能夠快速產(chǎn)生強大的先天免疫應答,其中干擾素信號通路最為經(jīng)典。目前,根據(jù)干擾素的來源、核苷酸和氨基酸序列、結(jié)構(gòu)、受體以及生物學功能的不同,將其分為Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)、Ⅱ型干擾素(IFN-γ)以及Ⅲ型干擾素(IFN-λ)。Ⅲ型干擾素是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類干擾素。進一步研究表明其生物學功能和信號通路與Ⅰ型干擾素較為相似,首先與IFN-lR1和IL-10R2組成的受體復合物結(jié)合后,激活Jak-STAT信號通路,誘導大量干擾素刺激基因表達。由于Ⅲ型干擾素特異性受體IFN-lR1在上皮細胞和組織的大量表達,研究表明Ⅲ型干擾素在粘膜表面發(fā)揮著比Ⅰ型干擾素更特異的抗病毒功能。豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)感染是一類致死率極高的烈性傳染病,具體癥狀表現(xiàn)為仔豬腹瀉,在世界范圍內(nèi)廣泛流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。腸道上皮細胞是其感染的主要靶細胞。本文首次對藏豬的IFN-λ3基因進行克隆、原核表達、并研究其對豬輪狀病毒的抗病毒活性。1.藏豬IFN-λ3基因克隆及生物信息學分析根據(jù)GenBank中豬IFN-λ3基因序列(登錄號:NM_001166490)設(shè)計引物,采用RT-PCR方法從藏豬腸道和肺臟中擴增出其IFN-λ3基因(ZPoIFN-λ3),將藏豬IFN-λ3基因克隆至pMD19-T載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-ZPoIFN-λ3。使用生物信息學軟件分析,藏豬IFN-λ3核酸序列與野豬核酸同源性為100%,完整ORF全長588bp。藏豬的IFN-λ3基因編碼蛋白共有23個氨基酸信號肽和172個氨基酸的成熟肽。藏豬IFN-λ3編碼的氨基酸序列含有13個磷酸化位點、5個糖基化位點,其中1個為N-糖基化位點,4個O-糖基化位點。藏豬IFN-λ3的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成。2.藏豬IFN-λ3成熟肽基因的原核表達及抗病毒活性檢測以pMD19-T-ZPoIFN-λ3質(zhì)粒為模板,克隆藏豬IFN-λ3成熟肽基因(pMD19-T-mZPoIFN-λ3),構(gòu)建原核表達載體pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3,于大腸桿菌BL21(DE3)中表達,成功表達大小約為34KDa的目的蛋白,并對誘導時間、IPTG濃度進行了優(yōu)化。通過超聲波破碎獲得的包涵體經(jīng)過鎳柱親和層析后,SDS-PAGE顯示蛋白為單一條帶。純化蛋白經(jīng)過透析復性濃縮,以此為免疫原制備鼠抗ZPoIFN-λ3多克隆抗體,經(jīng)Western Blotting鑒定,證明獲得的目的蛋白具有良好的免疫原性。采用細胞病變抑制法測定蛋白在MDBK/VSV的活性,結(jié)果顯示pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表達蛋白在MDBK/VSV系統(tǒng)的抗病毒效價為10×2~(4.5)IU/0.1mL,比活力為2×10~3IU/mg。3.藏豬IFN-λ3抗豬輪狀病毒活性研究將ZPoIFN-λ3原核表達產(chǎn)物以0、10、100、1000ng/mL的劑量預處理IPEC-J2細胞和MA104細胞24h后,接種0.1MOI PoRV SC-R株,于接種后36h收集細胞懸液�；蛞�100ng/mL的劑量預處理MA104細胞24h后,于接種0.1MOI PoRV SC-R株后12h、24h和36h收集細胞懸液。Q-PCR檢測樣品中PoRV VP6基因的mRNA水平,結(jié)果顯示不同劑量的原核表達產(chǎn)物在病毒接種IPEC-J2細胞和MA104細胞后均能有效地抑制PoRV SC-R株的增殖,并呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴,且低濃度的ZPoIFN-λ3(100ng/mL和10ng/mL)在IPEC-J2細胞的抗PoRV活性顯著強于在MA104細胞的活性,高濃度(1000ng/mL)則差異不顯著。為了探究ZPoIFN-λ3與豬IFN-α聯(lián)合應用能否增強其抗病毒活性,以0、0.1、1、10ng/mL ZPoIFN-λ3或者0、10、100、1000IU/mL豬IFN-α單獨或者聯(lián)合IFN-α+ZPoIFN-λ3(10IU/mL+0.1ng/mL,100IU/mL+1ng/mL,1000IU/mL+10ng/mL)預處理IPEC-J2細胞24h,接種0.01MOI PoRV SC-R株,于接種后36h收集細胞懸液,反復凍融三次后,以TCID_(50)測定病毒滴度。結(jié)果顯示所有劑量二者聯(lián)合應用均沒有ZPoIFN-λ3單獨應用抑制PoRV SC-R株增殖的活性強。為探究其中機制,相對熒光定量測定下游抗病毒蛋白MxA,OASL和ISG15轉(zhuǎn)錄情況,發(fā)現(xiàn)單獨使用ZPoIFN-λ3誘導的下游抗病毒蛋白轉(zhuǎn)錄均高于二者聯(lián)合應用。
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4
【圖文】：

圖 1-1 Ⅲ型干擾素與 I 型干擾素的表達和信號通路Figure1-1. General induction and receptor signaling pathways of type I and type III IFNs[23] Ⅲ型干擾素的生物學功能1 抗病毒功能在最初發(fā)現(xiàn)Ⅲ型干擾素時，研究人員就發(fā)現(xiàn)，在不同細胞分別感染登革熱病毒、泡口炎性病毒或腦心肌炎病毒可以誘導IFN-λ產(chǎn)生[5]。隨后大量報道稱在多種DNAA 病毒刺激下細胞能夠產(chǎn)生 IFN-λ，如仙臺病毒[24]、登革熱病毒[25]、輪狀病毒[26]吸道合胞病毒[27]等。IFN-λ可以誘導多種抗病毒蛋白的表達。由于Ⅲ型干擾素受體上皮組織和細胞的大量表達，研究表明Ⅲ型干擾素在粘膜表面發(fā)揮著Ⅰ型干擾素不替代的作用[28-30]。1.1 IFN-λ在呼吸道免疫中的研究呼吸道病毒常感染鼻竇、咽喉和肺臟。感染后主要產(chǎn)生 IFN-λs，而不是 IFN-α。

圖 2-1.藏豬 IFN-λ3 的 PCR 擴增PCR amplification of Tibetan IFN-λ3 gA Marker，1：PCR 產(chǎn)物，2：陰性對NA Marker, 1:PCR product, 2:Negativ-λ3 PCR 鑒定 PCR 擴增，擴增出與預期目標-2 pMD19-T-ZPoIFN-λ3 的 PCR 鑒定ation of the pMD19-T-ZPoIFN-λ3 gen

16圖 2-2 pMD19-T-ZPoIFN-λ3 的 PCR 鑒定ntification of the pMD19-T-ZPoIFN-λ3 gene usDNA Mrker，1-5：PCR 產(chǎn)物，6：陰性對照M:DNA Marker, 1-5:PCR product, 6:negative序結(jié)果BI 網(wǎng)站進行 Blast 比對，其與 GenBank，表明克隆成功，核酸序列如下：TCGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGAGGTGCCTGTCCCTGAAGCCCTCAGGTGGCCCAGTTCAAGTCTCTGTCCCCAAGGATGCCTTTGAAGAGTCCCTCT

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