發(fā)布時(shí)間：2020-08-21 22:21

【摘要】：豬胸膜肺炎(Porcine pleuropneumonia)是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的豬高度傳染的呼吸道疾病。APP具有18種血清型及多種毒力因子。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的豬胸膜肺炎疫苗為滅活疫苗和亞單位疫苗,但都存在不同程度的缺陷:滅活疫苗交叉保護(hù)力不足,亞單位疫苗免疫保護(hù)性因子有限,不能完全排阻細(xì)菌定植和持續(xù)感染。因此,有待進(jìn)一步了解APP的致病特點(diǎn),發(fā)掘更具有免疫保護(hù)潛力的抗原,以便開(kāi)發(fā)更為有效的疫苗。研究顯示,多種APP外膜脂蛋白在APP各種血清型中較為保守,被認(rèn)為是潛在的疫苗候選蛋白。本實(shí)驗(yàn)旨在篩選并鑒定APP免疫保護(hù)性強(qiáng)的脂蛋白,為開(kāi)發(fā)高效亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)�，F(xiàn)將研究過(guò)程和主要結(jié)論簡(jiǎn)述如下:1.脂蛋白克隆表達(dá)引物的設(shè)計(jì):本實(shí)驗(yàn)在前期研究中,通過(guò)生物信息學(xué)方法,從APP血清3型菌株JL03中,篩選到60個(gè)可能的脂蛋白,并對(duì)脂蛋白Lip40和PaIA的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。因此,本研究將對(duì)余下的58個(gè)脂蛋白的免疫活性進(jìn)行詳細(xì)分析。經(jīng)過(guò)序列分析,通過(guò)合理地去除了脂蛋白信號(hào)肽序列,引入合適的酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)了脂蛋白克隆表達(dá)的引物。2.脂蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建:以APP JL03菌株基因組為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增出58個(gè)脂蛋白基因。將58個(gè)脂蛋白基因片段連入pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,鑒定正確后提取質(zhì)粒,并雙酶切出正確的脂蛋白基因片段,連入原核表達(dá)載體pGEX-KG,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。最終獲得了 55個(gè)表達(dá)質(zhì)粒。3.重組脂蛋白的表達(dá)、純化及免疫反應(yīng)性分析:將構(gòu)建成功的55個(gè)脂蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21菌株,IPTG誘導(dǎo)重組脂蛋白超量表達(dá),共有47個(gè)脂蛋白基因能夠在大腸桿菌中表達(dá)。其中37個(gè)重組脂蛋白為可溶性表達(dá),10個(gè)重組脂蛋白為非可溶性表達(dá)。用親和層析法,純化37個(gè)可溶性重組脂蛋白,并通過(guò)免疫印跡法,鑒定蛋白的免疫反應(yīng)性。經(jīng)鑒定,共有31個(gè)重組蛋白具有免疫學(xué)活性。本研究從中篩選出免疫反應(yīng)性較強(qiáng)的5個(gè)脂蛋白(APJL 0386,APJL 0922,APJL 1380,APJL 1740和APJL 1976),進(jìn)行進(jìn)一步分析。4.對(duì)小鼠的免疫保護(hù)性的鑒定:以篩選到的5個(gè)免疫學(xué)活性較好的脂蛋白為免疫原,免疫BALB/c小鼠,共免疫兩次,然后用APP血清1型4074菌株對(duì)小鼠攻毒,以檢驗(yàn)這5種脂蛋白的交叉保護(hù)作用。通過(guò)ELISA和WesternBlot檢測(cè)小鼠體液免疫應(yīng)答水平,發(fā)現(xiàn)各組免疫原能激發(fā)特異性免疫應(yīng)答。APJL 1380、APJL 1976、APJL 0922、APJL 0386、APJL 1740對(duì)小鼠的保護(hù)率分別為92%、75%、75%、25%和42%。小鼠肺組織病理切片顯示,以GST和PBS免疫的肺組織顯示出動(dòng)物急性和出血性肺炎病癥,而免疫組中存活下來(lái)的小鼠顯示出健康的肺切片。以主動(dòng)免疫獲得的免疫血清被動(dòng)免疫BALB/c小鼠后,進(jìn)行攻毒。針對(duì)蛋白質(zhì)APJL_1380、APJL_1976、APJL_0922、APJL_0386和APJL_1740的抗血清對(duì)小鼠的保護(hù)率分別為83%、92%、67%、33%和25%。病理切片結(jié)果同主動(dòng)免疫結(jié)果相似,抗脂蛋白血清組小鼠顯示出健康的肺切片,而抗GST和PBS血清組顯示出明顯的肺部病變。通過(guò)本研究,從APP菌株中,篩選出APJL_0922、APJL_1380和APJL_1976這3個(gè)候選抗原,具有良好的免疫原性,能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生高水平的體液免疫應(yīng)答,且具有較高的免疫保護(hù)效力。這三個(gè)蛋白有望用于開(kāi)發(fā)新的高效胸膜肺炎放線桿菌亞單位疫苗,為豬胸膜肺炎的防控奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61
【圖文】：

氨酸殘基處通過(guò)酰胺連接脂肪酸［８９］。在酶切位點(diǎn)后第２、３、４處的氨基酸殘基逡逑在Ｌｐｐ在革蘭氏陰性菌的膜定位中起一定的作用。而脂蛋白在革蘭氏陰性菌與陽(yáng)性逡逑菌中的定位也有所不同［９（）］，具體見(jiàn)圖１－１。逡逑a懾義舷猶宋ⅰ觥鯖鴍_ｗ湖概媒ｍｒ棚期逡逑Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ邐ｊ＾Ｂ邐ＰＧ逡逑ｂａｃｔｅｒｉａ邐Ｊ／ｋ逡逑ＣＭ逡逑嫌。ｗ媒撕嫌sEｗ媒濟(jì)r>媒~枺髏絘義希危澹椋螅螅澹潁椋徨澹恚澹睿椋睿紓椋簦椋洌椋簀危攏錚潁潁澹歟椋徨澹猓酰潁紓洌錚潁媯澹潁殄危危澹椋螅螅澹潁椋徨澹恚澹睿椋睿紓椋簦椋洌椋簀義希牽危粒保梗矗跺危校玻插危牽危粒保福罰板義希跡攏懼濉鰣義希礎(chǔ)焊鞅窼�？邋醴逦ｕ，辶x希校清危輳矗椋停椋藎歟輳㈠義希牽潁幔恚穡錚螅椋簦椋觶邋義希猓幔悖簦澹潁椋徨危校清義希茫灣危�？辶x嚇錛ぁ鰚1■邐

本文編號(hào)：2799923