【摘要】：豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是一種經(jīng)糞-口途徑傳播的急性腸道傳染病,其病原為豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。PEDV雖然在感染成年豬時僅產(chǎn)生消瘦等輕微癥狀且鮮見死亡病例,但在感染新生仔豬時則表現(xiàn)出100%的高發(fā)病率和90%~100%的高致死率。PEDV目前在全球都已有感染并暴發(fā)的報道,嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。所以對PEDV的基礎(chǔ)研究提出了更高的要求,而基于現(xiàn)代測序技術(shù)的數(shù)據(jù)則具有一定的指導意義。為此,本研究將PEDV接種于無天然免疫缺陷的Marc-145細胞中,再借助于RNA測序(RNA-seq)技術(shù)及同位素標記相對和絕對定量(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification,iTRAQ)技術(shù)分別測定了感染PEDV前后的Marc-145細胞的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組的變化,并對兩組數(shù)據(jù)進行了生物信息分析及串聯(lián)分析,獲得了以下結(jié)果:1.將對照組及接毒組細胞進行基于RNA-seq技術(shù)的高通量測序,在測序數(shù)據(jù)與非洲綠猴(Chlorocebus sabaeus)參考基因組比對之后,將鑒定出的基因進行功能注釋,最后篩選出接毒組中呈現(xiàn)差異表達的基因,并對其進行GO(Gene Ontology)與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析,結(jié)果如下:從對照組與接毒組中分別鑒定到18452個與18286個基因中共篩選出832個差異表達基因,其中表達上調(diào)的有497個,表達下調(diào)的有335個;在GO分析的分子功能、細胞組分及參與的生物過程共3項本體中分別富集到440、291及2700條GO term,其中在生物過程中有27條GO term呈現(xiàn)為顯著富集,主要涉及信號轉(zhuǎn)導、應激及凋亡等,而在分子功能與細胞組分中富集程度最高的GO term則分別主要與DNA結(jié)合及細胞骨架成分有關(guān);在KEGG分析中共富集到167條Pathway,其中有涉及免疫反應、凋亡及細胞周期的Pathway,而呈顯著富集的Pathway則是與胞外信號轉(zhuǎn)導密切相關(guān)的MAPK與Jak-STAT信號通路;與天然免疫、炎性反應相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達,其中IFNB1、EGFR、IL11、RSAD2與ISG15等基因的表達出現(xiàn)了顯著上調(diào),表明在病毒的誘導下,細胞的天然免疫及炎性反應被激活,然而還有IFNA、IL23A等基因的表達出現(xiàn)了顯著下調(diào),表明PEDV可通過某些機制抑制了部分的天然免疫及炎性反應;與細胞凋亡相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達,其中TRAILR、DFF40、NGF等的上調(diào)表達與TRAIL、BIRC3的下調(diào)表達表明在一部分細胞中凋亡被誘導,而在另一部分細胞中凋亡被抑制,提示病毒可能通過對細胞凋亡的調(diào)控以實現(xiàn)更高的病毒滴度;與細胞周期相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達,其中GADD45B、p300、Mdm2等的上調(diào)表達與HSP105、HSP70等的下調(diào)表達提示可能發(fā)生了細胞周期阻滯。2.借助了iTRAQ串聯(lián)液相質(zhì)譜對接毒組及對照組的Marc-145細胞進行蛋白組學測序,將篩選出的差異表達蛋白進行GO與KEGG富集分析,結(jié)果如下:從鑒定到的3346個蛋白中共篩選出478個差異表達蛋白,其中表達上調(diào)的有423個,表達下調(diào)的有55個;在GO分析的分子功能、細胞組分及參與的生物過程共3項本體中分別富集到201、211及1342條GO term,其中顯著富集GO term分別為45、66及255條,分別主要涉及RNA結(jié)合與翻譯調(diào)控、細胞骨架與通道復合體、細胞周期與跨膜轉(zhuǎn)運等;在KEGG分析中共富集到包括p53、mTOR、MAPK信號通路在內(nèi)的67條pathway,其中顯著富集的有ErbB、HIF-1、Wnt、細胞周期信號通路等共29條;核糖體相關(guān)蛋白表達上調(diào),表明病毒可能正通過劫持細胞的蛋白合成機能來進行自身的復制,而其中RPL11、RPL23、RPL26、RPS25、RPS27等蛋白的上調(diào)表達則提示可能發(fā)生核糖體應激;與細胞骨架相關(guān)的蛋白的表達發(fā)生變化,其中DCTN2、TUBA4A、MAP4等表達上調(diào),而HSP27表達下調(diào),反映了細胞骨架在病毒的感染下發(fā)生異常,且HSP27的下調(diào)表達還提示細胞可能發(fā)生了凋亡;與細胞周期相關(guān)的Cdc2、Mad1、Bub3蛋白表達上調(diào),同樣提示了細胞周期阻滯的發(fā)生。3.在轉(zhuǎn)錄組學及蛋白組學測序的基礎(chǔ)上,對鑒定到的基因與蛋白進行了串聯(lián)分析。在103個同時在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平發(fā)生變化的蛋白中共發(fā)現(xiàn)有52個在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上呈現(xiàn)出一致性的變化,其中有35個出現(xiàn)上調(diào),17個出現(xiàn)下調(diào),這些蛋白主要與細胞骨架、細胞周期、信號轉(zhuǎn)導等有關(guān)。而在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上均呈現(xiàn)顯著上調(diào)的TRIM56則可能參與了細胞對抗病毒的免疫反應,但其在PEDV感染過程中的具體作用需要進一步研究來報道,這也是首次在PEDV感染細胞的過程中發(fā)現(xiàn)該蛋白的參與。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28

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本文編號：2799430