【摘要】：雞傳染性支氣管炎(IB)是由禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病。IBV M41株是IBV標(biāo)準(zhǔn)毒力株。雞胚腎(CEK)細(xì)胞來源于IBV易感宿主,能較好模擬IBV感染環(huán)境且同時(shí)具有較高的敏感性。CEK細(xì)胞作為一種宿主細(xì)胞模型,已經(jīng)廣泛地被應(yīng)用于研究IBV致病機(jī)制。細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡是各類生物體內(nèi)十分重要的生物學(xué)過程,兩者均積極地參與機(jī)體的發(fā)育和生長等過程。一直以來都有研究專注于病毒感染過程中自噬與凋亡所扮演的特殊角色。然而針對(duì)于IBV來講,自噬與凋亡的發(fā)生及其在病毒復(fù)制過程中起到何種關(guān)鍵作用至今未有系統(tǒng)性的深入研究。本試驗(yàn)首先研究了IBV感染CEK細(xì)胞后是否發(fā)生自噬和凋亡,利用Western Blot、免疫熒光技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和電鏡等方法進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果表明,IBV感染CEK細(xì)胞后0-48 h內(nèi)發(fā)生自噬和凋亡,自噬先升高后下降(30 h為轉(zhuǎn)折點(diǎn)),凋亡從30 h開始發(fā)生且持續(xù)升高,自噬和凋亡的發(fā)生有著一定的規(guī)律。Western Blot和病毒滴度試驗(yàn)檢測(cè)自噬對(duì)病毒復(fù)制影響的結(jié)果顯示,在0-48 h之內(nèi)激活自噬,病毒復(fù)制先增加后減少;抑制自噬的情況下,病毒復(fù)制先減少后增加,表明自噬先促進(jìn)病毒復(fù)制后抑制病毒復(fù)制。凋亡對(duì)病毒復(fù)制影響的結(jié)果顯示,在30-48 h之內(nèi)激活凋亡的情況下,病毒復(fù)制減少;抑制凋亡的情況下,病毒復(fù)制增加,表明凋亡抑制病毒復(fù)制。為了進(jìn)一步研究自噬和凋亡是否相互作用從而影響病毒的復(fù)制,利用Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法等進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果顯示,在病毒感染30 h和36 h,激活自噬的情況下,凋亡增加,抑制自噬的情況下,凋亡減少;而激活或抑制凋亡的情況下,自噬基本無變化。而42 h和48 h處,激活凋亡的情況下,自噬減少,抑制凋亡的情況下,自噬增加;而激活或抑制自噬的情況下,凋亡基本無變化。表明自噬先主導(dǎo)促進(jìn)凋亡,凋亡后主導(dǎo)抑制自噬;并且先是自噬對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用強(qiáng)于凋亡,后來是凋亡對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用強(qiáng)于自噬。綜上所述,IBV感染CEK細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡,自噬先促進(jìn)病毒復(fù)制后抑制病毒復(fù)制,凋亡抑制病毒復(fù)制。并且自噬先主導(dǎo)促進(jìn)凋亡從而抑制病毒復(fù)制,凋亡后主導(dǎo)抑制自噬也抑制病毒復(fù)制。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.31
【圖文】：

結(jié) 果 結(jié)果.1 IBV M41 株感染 CEK 細(xì)胞的建模.1.1 IBV M41 株感染 CEK 細(xì)胞用 100 倍 TCID50的 IBV（在 CEK 細(xì)胞上穩(wěn)定傳至第十代）感染 CEK 細(xì)胞后，在倒置鏡下觀察。結(jié)果如圖 3-1 所示，實(shí)驗(yàn)組中 IBV 感染 CEK 細(xì)胞后，呈現(xiàn)出細(xì)胞由原本的不規(guī)則船帆形狀逐漸變圓、固縮、聚集成團(tuán)、最后脫落。細(xì)胞對(duì)照組并無此變化。由此 IBV 可在 CEK 細(xì)胞上穩(wěn)定傳代，并發(fā)生典型的 CPE。

DNA 2000 Marker；2：IBV-NA 2000 Marker; 2: IBV-N; 感染 CEK 細(xì)胞的 RT-PR assay results of IBV-in病毒于 CEK 細(xì)胞 72 h 后計(jì)算病毒感染復(fù)數(shù)（M0 MOI 的 IBV 分別接種以觀察 IBV N 蛋白的表山羊抗兔 IgG，1：250表達(dá)量均顯著高于 0.1

選取0.1 MOI、1 MOI和10 MOI的IBV分別接種于CEK細(xì)胞于24 h后進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）實(shí)驗(yàn)，以觀察病毒特異性熒光的表達(dá)情況。一抗選取IBV全病毒多抗，1：250倍稀釋；二抗選取FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG，1：2000倍稀釋。結(jié)果如圖3-4所示，1 MOI下的病毒特異性熒光最多最亮，顯著多于0.1 MOI和10 MOI，10 MOI可能由于病毒接種量太大導(dǎo)致部分細(xì)胞已經(jīng)脫落死亡。綜合Western Blot和IFA的結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選取1 MOI進(jìn)行病毒接種最為恰當(dāng)。a24 h36 h0.1 MOI1.0 MOI10 MOI0.1 MOI1.0 MOI10 MOIIBV Nβ-actinb

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