發(fā)布時(shí)間：2020-08-19 15:10

【摘要】：畜禽種質(zhì)資源是維持生態(tài)安全、農(nóng)業(yè)穩(wěn)定的重要資源,它推動(dòng)著經(jīng)濟(jì)的繁榮與社會(huì)的進(jìn)步。重要的家養(yǎng)動(dòng)物種質(zhì)資源應(yīng)該受到重視,并得到有效的保護(hù)。間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外快速增殖并且可以向其他細(xì)胞分化。這些優(yōu)點(diǎn)使得它們成為畜禽種質(zhì)資源保存研究的新渠道。本實(shí)驗(yàn)以肉雞真皮來源和鵝心臟來源的間充質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)、生物學(xué)特性研究和誘導(dǎo)分化研究,并得到以下結(jié)果:1.利用膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶分離得到肉雞真皮間充質(zhì)干細(xì)胞(Dermal Mesenchymal Stem Cells,DMSCs),并在體外條件下培養(yǎng)31代,細(xì)胞形態(tài)主要為長梭形。RT-PCR鑒定結(jié)果顯示,細(xì)胞表達(dá)CD73、CD29、CD44,和CD71基因。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示肉雞DMSCs陽性表達(dá)CD105、CD90、CD73和CD44表面標(biāo)記物。通過流式細(xì)胞儀分析,CD29、CD44和CD73在肉雞DMSCs中高表達(dá)。DMSCs的生長曲線為明顯的“S"形,與細(xì)胞在體外增殖的通常規(guī)律基本吻合。DMSCs的群體倍增時(shí)間和克隆形成能力的結(jié)果表明細(xì)胞的增殖能力隨著代次的升高而減弱。研究表明肉雞DMSCs能夠在一定的條件下被分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞,通過特異性染色和RT-PCR鑒定證明肉雞DMSCs向這三種細(xì)胞成功分化。2.利用膠原酶II和胰蛋白酶分離得到鵝心臟間充質(zhì)干細(xì)胞(Heart-derived Mesenchymal Stem Cells,HMSCs),并在體外培養(yǎng)21代,細(xì)胞形態(tài)特征呈現(xiàn)梭狀。RT-PCR和免疫組化檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果都顯示細(xì)胞表達(dá)CD29,CD34,CD73,CD166和CD44等MSCs特異基因。通過流式細(xì)胞術(shù)分析,CD29,CD34,CD73,CD166和CD44在鵝HMSCs中高表達(dá)。HMSCs的生長曲線表明HMSCs經(jīng)過短暫潛伏期,進(jìn)入迅速增殖的對(duì)數(shù)期,而后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期,呈現(xiàn)出明顯的“S"形,與細(xì)胞體外生長的基本規(guī)律吻合。群體倍增時(shí)間結(jié)果表明HMSCs的增殖能力隨著代次的升高逐漸減弱。通過在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)因子對(duì)HMSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn),通過特異性染色和RT-PCR等方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HMSCs成功被分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞,說明鵝HMSCs可以向多個(gè)方向誘導(dǎo)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)了肉雞DMSCs和鵝HMSCs,并且對(duì)它們進(jìn)行了生物學(xué)特性研究和誘導(dǎo)分化研究。結(jié)果顯示,肉雞DMSCs和鵝HMSCs均表現(xiàn)出MSCs特有的生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)畜禽種質(zhì)資源保存具有重要的意義,并且為再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q813;S813
【圖文】：

加入阿利新藍(lán)染色觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況。同時(shí)提取兩組細(xì)胞的總 RNA-PCR 對(duì) ACAN 這種特定基因進(jìn)行檢測(cè)。特定基因引物序列見表 2.3。。阿利新藍(lán)染色：舍去原培養(yǎng)基，PBS 清洗 3 遍。舍去 PBS，加入 1mL 4 %多聚甲醛，固棄去固定液，PBS 清洗 3 次。舍去 PBS，加 2 mL 茜素紅染色液，室溫作用 30min。棄清洗 3 次。觀察細(xì)胞的染色情況，并拍照記錄。結(jié)果與分析 肉雞 DMSCs 的分離培養(yǎng).1 肉雞 DMSCs 的形態(tài)特征DMSCs 接種到 60 mm 培養(yǎng)皿中 24 h 之后，細(xì)胞成簇生長，折光性強(qiáng)，細(xì)胞生命力旺盛胞的形態(tài)大多數(shù)呈梭狀或多角形。長有細(xì)胞的地方，細(xì)胞密度較大，連接較為緊密。沒細(xì)胞的地方，細(xì)胞延展較好，形態(tài)較好觀察。培養(yǎng)皿中會(huì)混有死細(xì)胞和雜細(xì)胞，圖中發(fā)即為死細(xì)胞或未貼壁雜細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量符合傳代標(biāo)準(zhǔn)，遂進(jìn)行傳代（圖 2.1A）。此時(shí)度不再過分緊湊，細(xì)胞易于觀察。形態(tài)也趨于均一，大多數(shù)為長梭形。仍有少數(shù)雜細(xì)胞亡的細(xì)胞。當(dāng) DMSCs 密度達(dá)到 80% ～ 90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代（圖 2.1 B）。

Cellular morphology of DMSCs of P0-P31, respectively雞 DMSCs 的凍存情況MSCs 進(jìn)行傳代培養(yǎng)的同時(shí)，也對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保存，按每凍存管 1×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行凍存數(shù)量統(tǒng)計(jì)情況如表 2.4 所示。表 2.4 細(xì)胞凍存統(tǒng)計(jì)Table 2.4 Cellμlar cryopreservation代次 P3 P7 P9 P10 P13 P16 P19 P23 P25 P28 總計(jì)數(shù)量(管) 7 3 7 4 5 3 7 5 3 4 48雞 DMSCs 的生物學(xué)特性雞 DMSCs 的 RT-PCR 檢測(cè)測(cè)肉雞 DMSCs 表面標(biāo)記物。從 NCBI 系統(tǒng)中檢索了 GAPDH，CD29, CD44, CD73這些基因的編碼序列，并使用 primer5.0 進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)。RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表MSCs 表達(dá) CD29, CD44, CD71 和 CD73 這些 MSCs 特異基因, Marker 為 DNA Ma)。

圖 2.2 DMSCs 不同代次的細(xì)胞形態(tài)(40x)Fig.2.2 The cell morphology of DMSCs in different generations (40x)分別是 DMSCs P0 到 P31 代細(xì)胞形態(tài)Cellular morphology of DMSCs of P0-P31, respectively2.2.1.2 肉雞 DMSCs 的凍存情況對(duì) DMSCs 進(jìn)行傳代培養(yǎng)的同時(shí)，也對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保存，按每凍存管 1×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行凍存，DMSCs 保存數(shù)量統(tǒng)計(jì)情況如表 2.4 所示。表 2.4 細(xì)胞凍存統(tǒng)計(jì)Table 2.4 Cellμlar cryopreservation代次 P3 P7 P9 P10 P13 P16 P19 P23 P25 P28 總計(jì)數(shù)量(管) 7 3 7 4 5 3 7 5 3 4 482.2.2 肉雞 DMSCs 的生物學(xué)特性2.2.2.1 肉雞 DMSCs 的 RT-PCR 檢測(cè)檢測(cè)肉雞 DMSCs 表面標(biāo)記物。從 NCBI 系統(tǒng)中檢索了 GAPDH，CD29, CD44, CD73 和

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2797236