【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis)是一種古老的慢性消耗性人獸共患傳染病,主要由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起。結(jié)核病不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,還嚴(yán)重危害著人類的健康。結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞寄生過程中會分泌一些蛋白,然而這些分泌蛋白的作用機(jī)制并不清楚,探討這些分泌蛋白在結(jié)核分枝桿菌致病的過程中的作用機(jī)制,能夠?yàn)樾碌慕Y(jié)核疫苗研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。另外,我國結(jié)核病的狀況十分嚴(yán)峻,傳統(tǒng)的檢測方法已經(jīng)不能滿足臨床需求,此種狀況同樣存在于我國牛場。本實(shí)驗(yàn)針對結(jié)核病的診斷方法及疫苗研發(fā)的分子機(jī)制這兩個(gè)方面展開研究:1.利用CRISPR/Cas9的系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)ESAT6,MPT64和串聯(lián)親和層析標(biāo)簽ZZtag-3×Flag的三個(gè)Raw264.7細(xì)胞系。成功擴(kuò)增如下片段:Neomycin、ZZtag、TEV剪切酶識別位點(diǎn),3×Flag,mCherry以及重組同源臂Arm1和Arm2,經(jīng)過多次重疊PCR成功融合這7個(gè)片段后獲得串聯(lián)親和層析用重組載體命名為pMD18T-TAP。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建用于串聯(lián)親和層析的6個(gè)重組質(zhì)粒pMD18T-TAP、pMD18T-TAP-ESAT6、pMD18T-TAP-CFP10、pMD18T-TAP-HspX、pMD18T-TAPMPT64和pMD18T-TAP-Ag85B,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白(ESAT6、MPT64)以及串聯(lián)親和層析標(biāo)簽組合ZZtag-3×Flag的Raw264.7細(xì)胞系,然后利用串聯(lián)親和層析聯(lián)用質(zhì)譜的方法成功篩選出與ESAT6互作的宿主蛋白為Serine/arginine repetitive matrix protein 1,后續(xù)將驗(yàn)證ESAT6與Serine/arginine repetitive matrix protein 1的互作。2.本實(shí)驗(yàn)初步建立能在實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)核分枝桿菌H37Ra的三種方法:TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR。實(shí)驗(yàn)選取IS6110基因?yàn)榘谢?發(fā)現(xiàn)TB-LAMP、MDA-PCR能在幾十個(gè)結(jié)核分枝桿菌H37Ra存在時(shí)擴(kuò)增出陽性,且比直接菌液PCR擴(kuò)增的靈敏度高一個(gè)數(shù)量級。本實(shí)驗(yàn)首次嘗試改進(jìn)傳統(tǒng)HCR的方法將其用于結(jié)核分枝桿菌H37Ra的檢測,得到陽性結(jié)果,且靶定三個(gè)基因(IS6110,CFP10,GryB)時(shí),提高了HCR方法檢測的檢出率。本實(shí)驗(yàn)研究建立了TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR這三個(gè)方法,能夠用于結(jié)核分枝桿菌H37Ra的基因IS6110的檢測,并且首次將MDA-PCR和HCR的方法用于結(jié)核分枝桿菌H37Ra的檢測。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61
【圖文】：

圖 1-1 2016 年結(jié)核病發(fā)病率(標(biāo)注為至少十萬以上病例的國家) (WHO, 2017)Fig.1-1 Estimated TB incidence in 2016 (for countries with at least 100 000 incident cases)(WHO, 2017)1.1.2 結(jié)核分枝桿菌病原特性結(jié)核分枝桿菌呈細(xì)長略彎曲狀，聚集呈分枝狀排列增殖。因其細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)，用革蘭氏染色法不易著色，經(jīng)萋-尼式抗酸染色呈紅色，無菌毛和鞭毛，有莢膜，單在、成雙、間或成叢排列，結(jié)核分枝桿菌對培養(yǎng)基的要求很高，通常所用的培養(yǎng)基為羅氏培養(yǎng)基或者 7H9 培養(yǎng)基，生長極其緩慢且在生長的過程中容易聚集成團(tuán)，在培養(yǎng)基中加適量的吐溫能夠減少菌體成團(tuán)（Mcnerney R, et al., 2011）。在電鏡下觀察 Mtb 有復(fù)雜結(jié)構(gòu)：其由微莢膜，細(xì)胞外殼的三層結(jié)構(gòu)（胞漿膜、胞漿、間體），核糖體及中間核質(zhì)構(gòu)成。結(jié)核分枝桿菌對酸、堿和干燥的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗能力，對濕熱的環(huán)境很敏感，酒精和紫外線都可以將結(jié)核分枝桿菌殺滅（吳雪瓊，2006）。

結(jié)核分枝桿菌的檢測及其分泌蛋白與宿主互作的研究2009）；另一方面，有研究表明肉芽腫實(shí)際上是一種有效的擴(kuò)大細(xì)菌感染的工具（BoldT D, et al., 2009）。大多數(shù)感染 Mtb 的人可以保持沒有臨床癥狀的潛伏感染狀態(tài)，只有 5%-10%的感染 Mtb 的人會發(fā)展為活動性結(jié)核病病人。而大部分潛伏感染的病人體內(nèi)的 Mtb 處于休眠狀態(tài)，一旦機(jī)體的免疫機(jī)能下降，就會導(dǎo)致 Mtb 從感染病灶中釋放出來，擴(kuò)散進(jìn)入呼吸道，意味著肺結(jié)核的復(fù)發(fā)。在整個(gè)過程中，Mtb 與巨噬細(xì)胞之間的相互作用對機(jī)體感染后的走勢是很重要的（Mcnicholl J M, et al., 2000）。

結(jié)核分枝桿菌的檢測及其分泌蛋白與宿主互作的研究短，而且假陽性的結(jié)果也較少。傳統(tǒng)的標(biāo)簽組binding peptide, CBP）和蛋白 A 的 IgG 結(jié)合域（acco etch virus, TEV）蛋白剪切位點(diǎn)連接（Rigaut中內(nèi)源性鈣調(diào)蛋白會影響融合蛋白的結(jié)合，使親和層析的方法不斷地開發(fā)更新，已經(jīng)有幾十，新的標(biāo)簽在不同程度不同方面提高蛋白純化roteinC, 3×Flag-His, 2×StrepⅡ-Flag, SBP-His 和 Zet al., 2013）。程主要有：構(gòu)建 TAP 所用標(biāo)簽與目的蛋白融合細(xì)胞中得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞系，獲得純化得到蛋白復(fù)合物并進(jìn)行質(zhì)譜分析（Tang Z

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 徐峰;穆昕;王嵬;劉利新;;串聯(lián)親和純化技術(shù)篩選hCLP46的相互作用蛋白[J];中國科學(xué)院研究生院學(xué)報(bào);2011年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 伍享;結(jié)核分枝桿菌檢測方法的初探及其與宿主互作蛋白的篩選[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

本文編號：2796091