【摘要】：牦牛是藏區(qū)牧民重要的家畜,但其繁殖能力低,通常兩年一胎或三年兩胎,在其整個生命周期中高產(chǎn)者僅能產(chǎn)仔四到五頭。在牧草較為豐盛的條件下牦牛的發(fā)情期也較短,牦牛發(fā)情只有一到二天,這樣低的繁殖力遠遠滿足不了牧民的需求,同時也制約著牦牛種群的擴大。而且受自然條件和技術(shù)手段限制,其調(diào)控繁殖相關(guān)分子研究較少且不全面。因此,尋找牦牛繁殖調(diào)控相關(guān)分子標志物,解決其低繁殖力是亟待解決的重要問題。為了更深入研究牦牛生殖生理分子調(diào)控機制,進一步提高其繁殖力,本研究使用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法篩選牦牛黃體期和卵泡期卵巢的差異表達蛋白,并運用生物信息學(xué)分析這些差異表達蛋白質(zhì)的功能及參與生物學(xué)過程或代謝途徑。同時運用QRT-PCR、Western blot及免疫組化技術(shù),對采集的卵巢、子宮、輸卵管中差異表達蛋白進行定量、定性和定位研究,以期找出可能影響牦牛生殖的差異蛋白及其定位表達,實驗結(jié)果如下:(1)采用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析牦牛黃體期和卵泡期卵巢組織蛋白的變化,篩選兩個時期的差異表達蛋白,結(jié)果顯示:在黃體期鑒定到2867個蛋白,卵泡期鑒定到2180個蛋白,有2011個蛋白在這兩個時期中均表達,856個蛋白只在黃體期表達,169個蛋白只在卵泡期表達。差異表達蛋白63個(P0.05),其中黃體期較卵泡期有47個蛋白表達上調(diào),16個蛋白表達下調(diào)。(2)對篩選出的差異表達蛋白進行生物信息學(xué)分析,Go分析結(jié)果表明差異表達蛋白主要分布在細胞膜和胞外區(qū)部分,主要功能體現(xiàn)在粘連活性方面;對所鑒定出的卵巢差異表達蛋白進行了COG分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生、RNA加工和修飾、轉(zhuǎn)錄、生物信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶、代謝等蛋白質(zhì)均出現(xiàn),其中出現(xiàn)頻數(shù)最高的蛋白質(zhì)為發(fā)揮生物信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的蛋白質(zhì)類,而出現(xiàn)頻數(shù)最低的蛋白質(zhì)則為參與細胞運動的蛋白質(zhì);通過KEGG分析這些差異蛋白主要參與類固醇生物合成、趨化因子信號通路、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工、甘油磷脂代謝、碳代謝、PI3K-Akt信號通路、PPAR信號通路、NOD樣受體信號通路、嘌呤代謝途徑、RNA運輸途徑、胰臟分泌代謝途徑、RNA降解代謝途徑、HIF-1信號通路、AMPK信號通路、胰島素信號通路、鈣離子信號通路、谷胱甘肽代謝等途徑。(3)QRT-PCR與Western blot驗證了FSHR、LHR、St AR、Rab-8a、HSP105在牦牛黃體期與卵泡期的卵巢、子宮及輸卵管組織中的表達。結(jié)果表明:FSHR、St AR、HSP105在卵泡期表達量明顯高于黃體期,而LHR和Rab-8a則在黃體期呈現(xiàn)上調(diào)。FSHR在黃體期卵巢、子宮、輸卵管中呈現(xiàn)出明顯的下調(diào)作用;LHR在黃體期卵巢、子宮、輸卵管中均呈現(xiàn)上調(diào);黃體期與卵泡期相比,St AR在卵泡期卵巢組織中的表達是黃體期的5.05倍,在子宮中的表達是黃體期2.38倍,差異極顯著(P0.01),在輸卵管中的表達是黃體期的1.82倍,差異顯著(P0.05);Rab-8a在卵巢、子宮、輸卵管中的表達卵泡期均低于黃體期,差異顯著(P0.05);HSP105在卵巢、子宮、輸卵管中的表達黃體期均低于卵泡期(P0.05)。(4)免疫組化結(jié)果顯示:在黃體期,FSHR主要在卵巢顆粒細胞層、子宮固有膜的結(jié)締組織以及輸卵管的黏膜上皮細胞呈陽性表達;LHR主要在卵巢卵泡顆粒細胞層、子宮的黏膜上皮細胞及輸卵管的黏膜上皮細胞呈陽性表達;St AR主要在卵巢閉鎖卵泡的顆粒細胞層和輸卵管的黏膜上皮有弱陽性表達,但在子宮中未見表達;Rab-8a主要在卵巢閉鎖卵泡顆粒層細胞、子宮和輸卵管的黏膜上皮有弱陽性表達;HSP105主要在卵巢的結(jié)締組織和髓質(zhì)區(qū)動脈血管的肌層、子宮和輸卵管的黏膜上皮有陽性表達。在卵泡期,FSHR主要在卵巢的卵泡顆粒細胞層、子宮的黏膜上皮以及黏膜固有層的結(jié)締組織和子宮腺上皮細胞,以及輸卵管的黏膜上皮細胞均有陽性表達;LHR主要在卵巢的生殖上皮和初級卵泡、子宮的黏膜上皮細胞以及固有層的結(jié)締組織和子宮腺上皮細胞,以及輸卵管的黏膜上皮中均呈陽性表達;St AR主要是在卵巢的卵泡顆粒細胞層、子宮黏膜固有層的子宮腺上皮和結(jié)締組織以及輸卵管的黏膜上皮內(nèi)均有陽性表達;Rab-8a主要是在卵巢的卵泡顆粒細胞層、子宮黏膜固有層的結(jié)締組織及輸卵管的黏膜層上皮內(nèi)有弱陽性表達;HSP105主要是在卵巢的卵泡顆粒細胞層、子宮黏膜固有層的子宮腺上皮和輸卵管的黏膜上皮中均有陽性表達。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823.85
【圖文】：

圖 1 細胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標記原理Figure 1 Principle of stable isotope labeling of amino acid in cell culture譜多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（MRM）作為一種目標蛋白組定量技術(shù)，其主要依為三重四級桿質(zhì)譜[28]。首先使用液相分離蛋白質(zhì)，通過霧化器對電離蛋賦予電荷，再使用碰撞誘導(dǎo)分離母離子，最終使用三重四極質(zhì)譜儀對單子進行掃描（圖 2）。MRM 被用于鑒定野生型和突變型蛋白質(zhì)的差別于其高精準度故而可以用來精準定量，也可以用來回答關(guān)于單個細胞中絕對拷貝數(shù)的基本問題，其中在哺乳動物細胞和人體的數(shù)字建模以及腫異常蛋白的相對水平中是必不可少的，并且對于診斷有很重要的作用 也被用作觸發(fā)肽的完整產(chǎn)物離子掃描的方法，可以檢測低于檢測極限的后修飾[29, 30]的標準質(zhì)譜分析[31]。2017 年，MRM 已發(fā)展成為一種高度重復(fù)的基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)靶向檢測平臺，并且已經(jīng)證明基于 MRM 的在白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用方面優(yōu)于傳統(tǒng)的基于抗體的蛋白質(zhì)生物標志物診斷

Figure 1 Principle of stable isotope labeling of amino acid in cell culture質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（MRM）作為一種目標蛋白組定量技術(shù)，其主要依靠的儀器為三重四級桿質(zhì)譜[28]。首先使用液相分離蛋白質(zhì)，通過霧化器對電離蛋白質(zhì)樣品賦予電荷，再使用碰撞誘導(dǎo)分離母離子，最終使用三重四極質(zhì)譜儀對單一的母離子進行掃描（圖 2）。MRM 被用于鑒定野生型和突變型蛋白質(zhì)的差別，同時由于其高精準度故而可以用來精準定量，也可以用來回答關(guān)于單個細胞中蛋白質(zhì)的絕對拷貝數(shù)的基本問題，其中在哺乳動物細胞和人體的數(shù)字建模以及腫瘤中遺傳異常蛋白的相對水平中是必不可少的，并且對于診斷有很重要的作用。MRM 也被用作觸發(fā)肽的完整產(chǎn)物離子掃描的方法，可以檢測低于檢測極限的特定翻譯后修飾[29, 30]的標準質(zhì)譜分析[31]。2017 年，MRM 已發(fā)展成為一種高度靈敏且可重復(fù)的基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)靶向檢測平臺，并且已經(jīng)證明基于 MRM 的在臨床蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用方面優(yōu)于傳統(tǒng)的基于抗體的蛋白質(zhì)生物標志物診斷如ELISA[32]。

而選擇更合適的胚泡轉(zhuǎn)移時期。胚胎的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也在低級物種，例如斑馬魚中進行。這種模式生物體研究破譯脊椎動物發(fā)育中的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)時是有用的，但對于高等生物是不可能。因此，從它們獲得的結(jié)果來推斷哺乳動物的生殖應(yīng)謹慎對待[71]。 卵泡刺激素和黃體生成素的生理學(xué)意義卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）是由垂體前葉嗜堿性細胞泌和合成的一種由 α 和 β 兩個亞基組成的異質(zhì)二聚體組成的糖蛋白激素，β 亞與 α 亞基集合才能發(fā)揮 FSH 的生物學(xué)活性見圖 3[95, 96]。FSHβ 亞基氮端長度不致，故而 FSH 具有種屬差異。FSH 臨床上用于雌性動物，調(diào)控其發(fā)情周期使發(fā)情，或是在排卵期前促進卵泡和卵子的發(fā)育，從而促進排卵以達到體內(nèi)受精目的。Roker 和 Richards 等人證明 FSH 對于生育發(fā)育有重要的意義，主要功能引起卵泡的發(fā)育[13]，一定量的 FSH 可以抑制早期卵泡的閉鎖[14]。

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本文編號：2794027