【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一種危害極大的禽類傳染病,該病的流行給全世界的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的損失,19世紀曾發(fā)生過雞群的大量死亡,后來科學家將這種疾病稱為禽流感。隨著禽流感的流行,現(xiàn)在禽流感病毒(AIV)已經(jīng)出現(xiàn)了很多種亞型,其中H9N2亞型是其中的一種低致病性的亞型病毒,在漫長的時間里,H9N2已經(jīng)是較流行的禽流感病毒的亞型之一,所以如何預防禽流感一直是研究熱點。血凝素(Hemagglutinin,HA)是AIV上的重要蛋白,AIV侵襲細胞的關鍵。研究表明,HA在機體內(nèi)分解出HA2,HA2是重要的保守性抗原,一直是研究通用型疫苗的研究熱點。樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)在抗原呈遞過程中發(fā)揮重要的作用,CD205/DEC-205是DCs表面上的C型凝集素跨膜蛋白,DEC-205充當內(nèi)吞受體時,它加強DC的抗原攝取以及抗原遞呈作用,目前已有很多文獻證明了DEC205在抗原靶向DC過程中起到了這一作用。目前市場上流行的大多是全病毒滅活疫苗,且疫苗主要是通過雞胚培養(yǎng)或者是細胞培養(yǎng)的方式得到。但雞胚培養(yǎng)方式工藝復雜且一定程度上易殘留卵清蛋白,對雞蛋過敏的是不能通過這種方式獲得免疫的,細胞培養(yǎng)的方式容易污染且成本較高。所以研究出既安全又簡便的禽流感疫苗是一個重要的問題。本實驗研究的是通過減毒延遲裂解型沙門菌遞送禽流感HA2抗原預防H9N2型禽流感的DNA疫苗。本實驗具體研究內(nèi)容如下及結果如下:(一)靶向DCs的H9N2亞型禽流感病毒HA2抗原的裂解型沙門菌構建及反應原性研究。以合成的質(zhì)粒αDEC205-HA為模板,利用PCR擴增技術得到目的片段scFvDEC205-HA2和scFvDEC205-HA2-dimer,其中dimer是一種二聚體,可以結合雙倍的scFvDEC205和HA2,把這兩個目的片段與pYA4545載體連接構建出真核表達質(zhì)粒pYA4545-HA2-scFvDEC205和pYA4545-HA2-scFvDEC205-dimer,分別命名為HA2-scFv DEC205和HA2-scFvDEC205-dimer,中提質(zhì)粒以脂質(zhì)體3000轉染狀態(tài)良好的HEK-293T細胞中,培養(yǎng)48h后提取總蛋白,Western-blot和間接免疫熒光驗證目的蛋白成功表達后將質(zhì)粒轉入沙門菌χ11218,分別命名為pYL9,pYL11。(二)沙門菌pYL9和pYL11的免疫效果研究。將60只小鼠隨機分成6組,每組10只小鼠,分為已構建好的pYL9和pYL11和實驗室已有的χ11218(pYA4545)組(Empty vector組)、χ11218(pYA4545-HA2)組(HA2組),同時設立生理鹽水組(Saline組)和滅活疫苗組(Vaccine組),除了Vaccine組外,其余各組在第一次免疫后在每隔14天加強免疫一次,一共口服免疫4次,劑量為1×10~9CFU/只。其中Vaccine組的小鼠在第一次免疫時采用頸部皮下注射的方式進行免疫且只免疫一次。在第四次免疫后取小鼠脾臟、腸系膜淋巴結和PP結,通過流式細胞術檢測分析各組小鼠的DCs成熟分化情況以及T細胞分化情況,在免疫的第21和35天分別取小鼠血清,利用ELISA檢測小鼠血清中抗體滴度以及細胞因子的水平,四次免疫的一周后每組隨機挑選出7只小鼠進行攻毒試驗,攻毒劑量10~5EID_(50)即50μL/只,攻毒后14天內(nèi)記錄小鼠的體重變化以及死亡率,攻毒的14天后取小鼠肺部制作肺部的病理切片,觀察各組小鼠肺部的病理損傷情況。結果顯示:本實驗構建表達沙門菌pYL9和pYL11免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)與Saline組和Empty vector組相比小鼠脾臟中CD3~+CD4~+T細胞比例顯著上升5.1%,5.4%(P0.01),且與Empty vector組和HA2組相比pYL11組的CD3~+CD4~+T細胞中IL-4~+細胞占比顯著上升了1.49%,1.63%(P0.05),與Empty vector組相比pYL11組CD3~+CD4~+T細胞中IFN-γ~+細胞含量顯著升高了1.25%(P0.01),與HA2組相比pYL11組IFN-γ~+細胞含量顯著升高了1.61%(P0.001);與Saline組相比pYL11組脾臟中CD3~+CD8~+T比例也顯著上升了2.56%(P0.01)且與Empty vector組相比pYL11組的IFN-γ~+T細胞含量顯著升高了0.49%(P0.05)。脾臟中與Empty vector組相比pYL11組的DCs的CD83表達顯著增多了0.41%(P0.05),CD86表達顯著增多了34.8%(P0.001),腸系膜淋巴結中與Empty vector組相比pYL11組的DCs的CD80表達顯著增多了1.67%(P0.05),PP結中與Empty vector組相比pYL11組的DCs的CD80表達顯著增多了0.42%(P0.05)。ELISA分析血清中抗體滴度和細胞因子水平結果表明:在免疫的第21和35天時,與Empty vector組相比pYL11組的抗體滴度顯著升高了0.6%,0.28%(P0.05),與HA2組相比pYL11組血清中IFN-γ含量顯著升高了(P0.01)。攻毒后各組小鼠體重均開始下降,第七天時體重降到最低,pYL11組體重下降幅度較輕,生存曲線結果表明,pYL11組存活率為85.7%,Vaccine組的存活率也為85.7%,Empty vector和Saline組分別為57.1%和28.5%。各組小鼠肺部病理切片的HE染色結果說明,pYL11組和pYL9組還有Vaccine組的病理變化較輕,Saline組和Empty vector組的小鼠肺部均有嚴重的肺部間質(zhì)增厚,炎性細胞浸潤增多的現(xiàn)象。綜上所述,免疫小鼠后減毒沙門菌pYL9和pYL11組小鼠的CD3~+CD4~+T細胞和CD3~+CD8~+T細胞占比顯著上升,且IL4~+T細胞和IFN-γ~+T細胞含量都顯著上升,DCs表達的CD80、CD83、CD86顯著上升,血清中抗體水平上升,攻毒后小鼠沙門菌組小鼠的肺部病變程度要輕于對照組,說明沙門菌pYL9和pYL11對小鼠抵抗H9N2感染具有一定的保護效果,其中pYL11組效果更佳。
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4
【圖文】：
圖 2：HA2-scFvDEC205 基因片段的擴增子質(zhì)量標準；1：HA2-scFvDEC205 基因片段的ig.2Amplification of HA2-scFvDEC205 geneAMarker；1：Product for HA2-scFvDEC205 gedimer 基因的 PCR 擴增 的基因片段，其大小與設想的一致（見圖2010bpM 15000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp
HA2-scFvDEC205 基因片量標準；1：HA2-scFvDEmplification of HA2-scFvDrker；1：Product for HA2 基因的 PCR 擴增因片段，其大小與設想M 1
pYA4545-HA2-scFvDEC205 菌落 PCR 鑒定準；1：HA2-scFvDEC205 基因片段；2：陰性；3：陽性545-HA2-scFvDEC205 colony PCR identificationker; 1: HA2-scFvDEC205 gene fragment; 2 : negative contro3:positive controlM 1 2 32010bp
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