【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells BMSCs)是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的一種成體多能祖細(xì)胞,能夠支持造血干細(xì)胞的生長(zhǎng),被分離后可在體外進(jìn)行擴(kuò)增而不會(huì)喪失多能性,在特定條件下還能分化成成骨,軟骨,脂肪,肌肉,神經(jīng),內(nèi)皮等多種間充質(zhì)譜系組織,目前被廣泛用于再生醫(yī)學(xué)、組織工程、禽類發(fā)育生物學(xué)以及生產(chǎn)嵌合體等研究。目前有關(guān)BMSCs的研究多集中于人、鼠、兔和羊等哺乳動(dòng)物,鮮有雞BMSCs研究的相關(guān)報(bào)道。所以,雞BMSCs的分離純化以及體外培養(yǎng)體系的建立勢(shì)在必行。本研究旨在建立雞BMSCs分離培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步利用BMSCs生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞以及細(xì)胞水平上的基因編輯奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)選擇了 1-15日齡的廣西黃羽雞作為試驗(yàn)材料。首先無(wú)菌分離出雞的股骨和脛骨并剪除股骨和脛骨的兩骨骺端,然后用D-PBS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F12)沖洗出全部骨髓,隨后通過(guò)Ficoo1400密度梯度離心法對(duì)BMSCs進(jìn)行初步純化,最后在傳代培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)差速消化差速貼壁的方法對(duì)BMSCs進(jìn)行再次純化。當(dāng)分離培養(yǎng)的BMSCs純度達(dá)到90%以上時(shí),通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、增殖動(dòng)力學(xué)檢測(cè)、集落形成能力試驗(yàn)、組織化學(xué)檢測(cè)、RT-PCR分析對(duì)其初步鑒定,之后再通過(guò)體外分化試驗(yàn)和嵌合體試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。其中組織化學(xué)檢測(cè)主要運(yùn)用了糖原染色(PAS)、堿性磷酸酶檢測(cè)(ALP)、細(xì)胞表面標(biāo)志物的免疫熒光檢測(cè)(IF)、油紅O染色等方法;RT-PCR分析試驗(yàn)則是通過(guò)設(shè)計(jì)相關(guān)引物來(lái)檢測(cè)細(xì)胞是否表達(dá)BMSCs細(xì)胞表面的幾種標(biāo)志物基因,和控制多能性的幾種轉(zhuǎn)錄因子;體外分化試驗(yàn)則是對(duì)BMSCs進(jìn)行了成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化,然后通過(guò)組織化學(xué)檢測(cè)和RT-PCR分析來(lái)驗(yàn)證分化結(jié)果;嵌合體試驗(yàn)是通過(guò)將EDU標(biāo)記的BMSCs注射到孵育53小時(shí)的雞胚背主動(dòng)脈中,然后通過(guò)換殼培養(yǎng)繼續(xù)孵育,在第7天和11天時(shí)檢測(cè)雞胚中的EDU信號(hào)的方法進(jìn)行。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察表明本研究所分離的細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿后,會(huì)在12-24h貼壁,細(xì)胞形態(tài)會(huì)從圓形逐漸變?yōu)榧忓N形、橢圓形、扁平形等多種形狀。在用差速消化差速貼壁的方法對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步純化的過(guò)程中,細(xì)胞形態(tài)趨于統(tǒng)一并表現(xiàn)為典型的成纖維狀。增殖動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究所分離的細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中其生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”型,并隨著細(xì)胞代數(shù)的增加,其倍增時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。集落形成能力試驗(yàn)說(shuō)明本研究所分離的細(xì)胞有形成集落的潛力,并且隨著細(xì)胞接種量的增多,形成集落的數(shù)量增多。組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果為:糖原染色陽(yáng)性,堿性磷酸酶檢測(cè)陰性,細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44以及波形蛋白免疫熒光染色陽(yáng)性,造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45免疫熒光染色陰性。RT-PCR分析結(jié)果顯示BMSCs表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志物基因CD29、CD44、CD71,以及控制細(xì)胞多能性的轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Myc、Nanog、PouV。體外分化試驗(yàn)表明本研究所分離的細(xì)胞具有多向分化的潛能,在特定條件下可以分化成成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞。嵌合體試驗(yàn)結(jié)果表明我們所分離的細(xì)胞有潛力成為制備嵌合體的有力工具。本研究所分離的廣西黃羽雞來(lái)源的BMSCs具有易于分離、擴(kuò)增、免疫原性低以及體外培養(yǎng)時(shí)能長(zhǎng)期生成并維持多系分化的潛能的特點(diǎn)。有希望運(yùn)用于再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞移植治療、禽類發(fā)育生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因雞的制備等方面。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.1
【圖文】：

Ａ、Ｂ：分離后接種第５天的ＢＭＳＣｓ；邋Ｃ、Ｄ：分離后接種第１１天的ＢＭＳＣｓ邋（標(biāo)尺：逡逑１００邋Ｕ邋ｍ）逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＢＭＳＣｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ＰＯ邋ｐｈａｓｅ邋ｓｅｐａｒａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｄｅｎｓｉｔｙ邋ｇｒａｄｉｅｎｔ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ逡逑Ａ，邋Ｂ：邋ＢＭＳＣｓ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋５ｔｈ邋ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；邋Ｃ，邋Ｄ：邋ＢＭＳＣｓ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｏｎ逡逑ｔｈｅ邋１１ｔｈ邋ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋（ｓｃａｌｅ：邋１００邋＼ｘｍ）逡逑２．３．２差速貼壁培養(yǎng)法純化與培養(yǎng)ＢＭＳＣｓ結(jié)果逡逑根據(jù)ＢＭＳＣｓ與其他細(xì)胞貼壁能力、沉降速度的差異，通過(guò)控制消化時(shí)間和接逡逑種后首次換液時(shí)間對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的純化。按照本實(shí)驗(yàn)所建立的差速貼壁的純化逡逑方法，ＢＭＳＣｓ逐漸得到純化，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)的日漸統(tǒng)一。ＰＩ、Ｐ２時(shí)期在培養(yǎng)皿逡逑中還可看到大量的雜細(xì)胞，到Ｐ３時(shí)就可看到純度約在９０°／。以上的ＢＭＳＣｓ。在本實(shí)逡逑驗(yàn)所建立的培養(yǎng)體系中ＢＭＳＣｓ表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀況，細(xì)胞呈典型的成纖維狀，逡逑細(xì)胞體積大，邊緣光亮，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定（圖２－２）。逡逑

３．邋５ｃｍ的細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別接種１０００和１００００個(gè)細(xì)胞時(shí)，經(jīng)過(guò)７天的培養(yǎng)，集逡逑落逐漸形成，在倒置顯微鏡下觀察雞ＭＳＣ分別形成２５±８和７０±邋１０個(gè)直徑大于逡逑３ｍｍ的可見(jiàn)集落（圖２－３）。逡逑：

本文編號(hào)：2787348