【摘要】：鎘(Cd)是一種危害極大的重金屬污染物,它能造成機體氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)細胞損傷�；钚匝�(ROS)是機體內(nèi)含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱,過量的ROS可造成機體損傷。研究發(fā)現(xiàn),鎘中毒會使細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS,并且發(fā)生細胞自噬,這提示ROS可能與鎘誘導(dǎo)的自噬存在關(guān)聯(lián)。黃芪多糖(APS)是黃芪提取物中具有抗氧化、抗應(yīng)激等生物學(xué)功能的多糖,但目前關(guān)于APS對動物鎘中毒影響的研究很少。因此,本試驗以雞胚成纖維細胞(CEF)為研究對象,在建立染鎘CEF自噬和損傷模型的基礎(chǔ)上,研究APS與ROS之間的關(guān)系以及APS對鎘誘導(dǎo)細胞自噬損傷的影響及機制。首先,為建立Cd誘導(dǎo)CEF自噬和損傷模型,將CdCl_2溶液以不同劑量、不同時間孵育CEF,檢測CEF內(nèi)自噬蛋白LC3的表達及細胞活力變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同濃度CdCl_2溶液孵育的CEF內(nèi)LC3均有不同程度的表達,在10μmol/L的濃度、孵育36 h時CEF內(nèi)LC3表達量最高且細胞發(fā)生損傷。之后,為研究APS通過ROS抑制Cd致CEF的損傷作用,將CEF分為對照組、10μmol/L Cd組、自噬抑制劑3-MA+Cd組、3-MA組、自噬激活劑RAPA組、活性氧抑制劑NAC+Cd組、NAC組、40μg/mL APS+Cd組、APS組,通過DCFH-DA染色法檢測細胞內(nèi)ROS含量的變化,生物化學(xué)方法檢測過氧化物丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性變化,自噬體檢測試劑盒檢測自噬小體數(shù)量變化,Western-blot法檢測自噬蛋白LC3、Beclin-1、mTOR表達變化,超微透射電鏡技術(shù)觀察CEF的病理形態(tài)變化,CCK-8法檢測CEF活力變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)Cd組CEF內(nèi)ROS含量較C組顯著升高(P0.05),而NAC+Cd組、APS+Cd組CEF內(nèi)ROS與Cd組相比顯著降低(P0.05);(2)Cd組CEF內(nèi)MDA含量顯著高于C組,SOD和GSH-Px活性顯著低于C組(P0.05),而APS+Cd組CEF中MDA含量與Cd組相比顯著降低(P0.05),SOD和GSH-Px活性極顯著高于Cd組(P0.05);(3)自噬體數(shù)量檢測顯示,RAPA組、Cd組與C組相比自噬體數(shù)量顯著增加(P0.05),3-MA+Cd組與Cd組相比自噬體數(shù)量顯著減少(P0.05);(4)Western-blot結(jié)果顯示,Cd組CEF內(nèi)LC3與Beclin-1的表達顯著高于C組(P0.05),APS+Cd組中LC3與Beclin-1的表達較Cd組明顯降低(P0.05);mTOR蛋白表達在Cd組顯著低于C組(P0.05),APS+Cd組中mTOR的表達與Cd組相比顯著升高(P0.05);3-MA+Cd組與Cd組相比LC3表達量均顯著降低(P0.05);(5)透射電鏡下可見Cd組CEF內(nèi)有自噬體增多、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、線粒體脊模糊,CCK-8檢測結(jié)果顯示細胞活力明顯降低,而APS+Cd組的細胞形態(tài)、細胞活力均較Cd組有明顯改善。綜上,Cd可通過ROS誘導(dǎo)CEF自噬引起細胞損傷,而APS能夠顯著減少染鎘CEF內(nèi)ROS的產(chǎn)生、降低染鎘CEF中LC3及Beclin-1蛋白的表達、提高mTOR的表達和抗氧化水平、恢復(fù)染鎘CEF的細胞活力和形態(tài)損傷,表明APS可通過減少ROS生成減輕鎘致CEF自噬誘導(dǎo)的細胞損傷。本研究為進一步探討APS干預(yù)鎘中毒導(dǎo)致機體損傷作用及機制提供了科學(xué)的實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S859.8

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