發(fā)布時間：2020-08-03 19:48

【摘要】：瘧原蟲是一種寄生在紅細胞內的胞內寄生蟲,其生長繁殖主要都在紅細胞內完成。由于紅細胞內缺少維持正常生命活動所需要的細胞器,所以在受到氧化壓力時,寄生在紅細胞內的瘧原蟲DNA更容易受到氧化損傷,受到損傷的瘧原蟲是怎樣進行自我修復的,其修復機制又是什么?這對瘧原蟲的相關免疫逃避機制、以及新型藥物與疫苗的研制具有重要的意義。在本實驗中,我們通過生物信息學分析篩選得到了瘧原蟲Tat D-like DNase蛋白質,該蛋白質具有保守的Tat D DNase結構域,是具有金屬離子依賴性的脫氧核糖核酸酶,其蛋白質的結構與生物學特性同大腸桿菌Tat D蛋白質類似,且大腸桿菌Tat D蛋白質已經被證實參與到大腸桿菌DNA的氧化損傷修復過程當中。所以本課題試圖揭示,在瘧原蟲中Tat D-like DNase是否具有與大腸桿菌的Tat D類似的修復DNA損傷的功能,并以此為基礎對其作為疫苗候選抗原的免疫原性進行相關研究。首先,我們利用PCR技術對不同流行地區(qū)的惡性瘧原蟲Tat D-like DNase基因進行擴增對其保守性進行分析。結果顯示,各流行地區(qū)的惡性瘧原蟲野生株編碼Tat D-like DNase的m RNA序列完全相同;差異均發(fā)生在內含子區(qū)且僅存在5%的差異。由此可知,惡性瘧原蟲Tat D-like DNase基因在各流行地區(qū)都十分保守,這為以該蛋白質作為藥物候選靶標與疫苗候選抗原奠定了基礎。其次,利用間接免疫熒光試驗(IFA)對Tat D-like DNase在蟲體內的分布情況進行定位。結果顯示,在惡性瘧原蟲配子體時期、伯氏瘧原蟲有性與無性階段該蛋白質均有表達,且分布為于蟲體的細胞膜附近。Tat D-like DNase蛋白質在瘧原蟲各個發(fā)育階段均有表達的特性,為Tat D-like DNase作為瘧原蟲傳播阻斷疫苗的候選抗原提供了理論依據。最后,我們通過單細胞凝膠電泳試驗與蛋白質遷移試驗,證明了該蛋白質在氧化壓力存在的情況下,基因的轉錄水平上調,蛋白質遷移到細胞核位置參與到修復DNA損傷的過程。通過對伯氏瘧原蟲野生株與Tat D-like DNase敲除株進行比較研究發(fā)現(xiàn),Tat D-like DNase缺陷株的蟲體毒力、感染能力與致死性顯著下降,并且在蟲體受到氧化壓力時Tat D-like DNase缺陷株DNA損傷情況較野生株嚴重。由此證明了在瘧原蟲中,Tat D-like DNase參與了DNA氧化后損傷修復的過程。在免疫保護性方面,我們證明了Tat D-like DNase抗體可以有效地抑制伯氏瘧原蟲在小鼠體內的生長發(fā)育及配子體的出絲率;有效降低合子在蚊體內的形成數量;我們采用不同佐劑與Tat D-like DNase蛋白質混合免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)Montanide ISA51佐劑具有良好的保護效果與免疫原性。以上結果顯示,瘧原蟲Tat D-like DNase蛋白質具有修復蟲體DNA損傷的功能,且能有效地抑制蟲體有性時期與無性時期的發(fā)育,該蛋白質具有作為瘧疾紅內期疫苗與傳播阻斷疫苗候選抗原的潛質。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.72
【圖文】：

圖 1.1 PfTatD-like DNase 的結構域分析Figure 1.1 Structure analysis of PfTatD-like DNas結構分析，由圖 1.2 可以看出，PfTatD-like DNaaa（1-23 aa）的信號肽結構，根據信號肽假說我們質網加工分泌途徑進行加工，并在轉運過程中穿過。然后我們通過 swiss model 對該蛋白進行建模，行預測。由圖 1.3 可以看出該蛋白質由 6 個 α 螺旋包裹在其內部。由于其末端 α 螺旋為發(fā)揮脫氧核糖被包裹在其結構內部，并利用其活性中心對其進行

圖 1.3 PfTatD-like DNase 3D 模型構建ure 1.3 PfTatD-like DNase 3D model constru圖中藍色片段為 α 螺旋，綠色片段為 β 折疊rts is αhelices and purple parts is β-pleated sheets in 分析 軟件，將PfTatD-likeDNase 與不同種屬瘧原蟲 進化樹。如圖 1.4，PfTatD-like DNase（PF3D7原蟲的TatDDNase親緣關系較近；與DNaseI遠。

圖 1.3 PfTatD-like DNase 3D 模型構建Figure 1.3 PfTatD-like DNase 3D model construction圖中藍色片段為 α 螺旋，綠色片段為 β 折疊In figure the green parts is αhelices and purple parts is β-pleated sheets in the secondary structure1.3.2 生物進化樹分析利用 Mega6.0 軟件，將PfTatD-likeDNase 與不同種屬瘧原蟲的DNase 共同構建minimum-evolution 進化樹。如圖 1.4，PfTatD-like DNase（PF3D7_0112000）（紅色方框）與其他種屬瘧原蟲的TatDDNase親緣關系較近；與DNaseI 和DNaseIII 在進化關系上親緣關系較遠。

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1 陳海峰,黃迪;鼻咽癌患者血清中抗Epstein-Barr病毒特異性DNA酶抗體檢測方法的探討[J];中山醫(yī)科大學學報;1988年01期

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本文編號：2780108