【摘要】：為大力推進畜牧業(yè)生產(chǎn)方式的轉(zhuǎn)變,國家生豬規(guī)范化生產(chǎn)技術日漸成熟。然而,由于生豬飼養(yǎng)環(huán)境未能得到根本性的改善,導致豬傳染性疾病對養(yǎng)豬業(yè),甚至人類的健康危害日趨嚴重。診斷、治療及防控的難度越來越大,對于新發(fā)現(xiàn)的病原以及多種病原體混合感染的診斷需求尤為迫切。仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS),是近些年我國多地區(qū)豬場發(fā)生的一種慢性、進行性的疾病,其病因較為復雜,致死率極高,主要為豬圓環(huán)病毒感染。最近研究發(fā)現(xiàn),PMWS存在豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)與其他病原的混合感染。自發(fā)現(xiàn)PMWS以來,圍繞著PMWS病原的研究不斷深入。PCV與PMWS高度相關,PMWS病豬的病變組織中均發(fā)現(xiàn)大量的PCV2抗原,借助于細胞培養(yǎng)技術分離出PCV2病毒,但沒有分離到其它病原。而在PMWS現(xiàn)場的病例中發(fā)現(xiàn),其臨床表現(xiàn)特定病變與PCV2嚴重程度一致。PMWS病例中經(jīng)常檢出PCV2而較少檢出其它病原的結果,表明PCV2是PMWS的主要病原,單獨感染能夠引起PMWS。細環(huán)病毒(Transfusion Transmitted Virus或Torque teno virus,TTV),為指環(huán)病毒科(Anelloviridae)細項環(huán)病毒屬成員(Anellovirus),是一種無囊膜DNA病毒,基因組呈單鏈、閉合環(huán)狀。豬細環(huán)病毒(Torque Teno Sus,TTSuVs)能夠感染很多外表健康的動物。TTSuVs病毒本身的感染不會立刻引發(fā)疾病。但是TTSuVs可以影響一些疾病的發(fā)生和發(fā)展,甚至影響它們的結果。目前還沒有報道TTSuVs直接與豬某些疾病的發(fā)生有關。由于PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征,而PCV2的遺傳關系與TTSuVs最為接近,有學者認為PMWS等由豬圓環(huán)病毒引起的相關疾病(PCVD)可能是PCV2與TTSuV協(xié)同感染引起的。為此本研究構建PCV2與TTSuV2雙重熒光定量PCR檢測方法,為在臨床上能夠同時快速、準確檢測PCV2與TTSuV2提供方案,為分析PCV2與TTSuV2的協(xié)同致病性提供途徑。1.PCV2型實時熒光定量PCR檢測方法的建立提取病料中病毒基因組,根據(jù)GenBank公布的PCV2序列保守區(qū)設計特異性引物進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物純化后與克隆載體連接,構建標準質(zhì)粒。以標準質(zhì)粒為模板,進行引物濃度、退火溫度、Taq酶用量的優(yōu)化,繪制實時熒光定量PCR的標準曲線,建立PCV2實時熒光定量PCR檢測方法。PCV2單重熒光定量PCR最佳反應體系為:Premix Ex Taq(2×)12.5μL,引物1.0μM,探針0.75μM,DNA模板3μL,水補至20μL。優(yōu)化后反應條件為:95℃,30 s;95℃,10s;56.6℃,30 s;35個循環(huán)。2.TTSuV2型實時熒光定量PCR檢測方法的建立提取病料中病毒基因組,根據(jù)GenBank公布的TTSuV2序列保守區(qū)設計特異性引物進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物純化后與克隆載體連接,構建標準質(zhì)粒。以標準質(zhì)粒為模板,進行引物濃度、退火溫度、Taq酶用量的優(yōu)化,繪制實時熒光定量PCR的標準曲線,建立TTSuV2型實時熒光定量PCR檢測方法。TTSuV2單重熒光定量PCR最佳反應體系為:Premix Ex Taq(2×)12.5μL,引物1.0μM,探針1.0μM,DNA模板3μL,水補至20μL。優(yōu)化后反應條件為:95℃,30 s;95℃,10 s;55.6℃,30 s;35個循環(huán)。3.PCV2型與TTSuV2型雙重熒光定量PCR檢測方法的初步應用通過DNASTAR軟件分析,確認兩個探針,四個引物相互之間不會形成引物二聚體,尋找最佳的退火溫度和引物及探針濃度。結果顯示,TTSuV2及PCV2雙重熒光定量PCR的最佳條件如下:引物濃度分別為PCV2 1.0μM、TTSuV2 1.0μM;探針濃度分別為PCV2 1.0μM、TTSuV2 1.0μM;反應條件為95℃、30 s,95℃、10 s,55.8℃、30 s,35個循環(huán)。在此條件下雙重熒光定量PCR對兩種標準品的最低拷貝數(shù)均為1×10~2 copies/μL,不存在非特異性擴增曲線,無交叉反。應用所建立的雙重熒光定量PCR檢測方法,對2017-2018年8月期間,送檢至吉林農(nóng)業(yè)科技學院豬生態(tài)養(yǎng)殖及疫病防控中心的300份血清樣本進行檢測,結果顯示PCV2單獨感染率檢出率為36.0%,TTSuV2單獨感染檢出率為60.0%,兩種病毒混合感染檢出率為14.8%。本研究建立的2型豬細環(huán)病毒及2豬圓環(huán)病毒雙重熒光定量PCR檢測方法比普通PCR方法更敏感、特異,且具有較好的臨床實用性,可用于臨床樣品的檢測。
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

CV2 編碼的蛋白質(zhì)。該圖基于 PCV2 菌株 CC1 的全長基因組[8]。由 O是功能性蛋白質(zhì)，而其他 ORF 編碼蛋白質(zhì)的功能仍未可知�！鸀� ORrotocol for deriving proteins encoded by the PCV2 genome. This protocoenome of PCV2 strain CC1[8]. The proteins encoded by ORFs 1 to 4 are cud may be functional proteins, while the functions of other proteins are steading frame direction2 感染期間，細胞 DNA 復制參與病毒 DNA 復制，PCV2 的主細胞[1,14]。另外，病毒誘導細胞沒多種信號通路的改變路改變包括 PCV2 增殖，細胞凋亡和細胞自噬，以及抗胞信號傳導途徑相關的蛋白質(zhì)可能為抗 PCV2 病毒的靶標碼的相關蛋白 ORF1 是高度保守區(qū)，可編碼病毒 DNA 復制的關鍵蛋白p 蛋白含有 314 個氨基酸（aa），N-糖基化含有 3 個核定位

R 檢測雙重熒光定量 PCR 檢測方法 陽性標準品的制備布的 PCV2 和 TTSuV2 序列保病毒 DNA 為模板，進行 PCR藍白斑篩選。選取白色菌落進送至上海生工公司進行測序。結 EF371530.1 同源性為 98%，結表的毒株 KY742740.1 同源性uV2 陽性標準品的制備。

圖 2-2 PCV2 序列對比結果Fig2-2 Results of PCV2 sequence comparison圖 2-3TTSuV2 序列對比結果Fig 2-3 Results of TTSuV2 sequence comparisonCV2 與 TTSuV2 單重熒光定量 PCR 檢測方法的建立取 PCV2 與 TTSuV2 重組質(zhì)粒，使用 UV-1800（島津）對陽性質(zhì)粒度的鑒定。分別調(diào)整重組質(zhì)粒濃度至 1×1011copies/μL. 以標準質(zhì)粒

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本文編號：2779998