【摘要】：三甲基甘氨酸可以促進脂肪分解酶表達以及抑制脂肪合成相關酶表達,從而降低豬背膘厚,減少皮下脂肪；同時,三甲基甘氨酸可緩解高脂引起的肝臟脂肪變性以及脂肪組織功能紊亂。目前,關于三甲基甘氨酸作用機制的研究發(fā)現(xiàn),三甲基甘氨酸調(diào)節(jié)脂肪沉積與AMPK關系密切。但是三甲基甘氨酸是否通過激活AMPK,進一步影響其下游信號通路,從而發(fā)揮降低機體脂肪沉積的作用還有待深入研究。因此,本試驗以AMPKα1敲除小鼠為模型,利用高脂飼料誘導肥胖,首先在體內(nèi)試驗中,研究了三甲基甘氨酸對高脂誘導的野生型和AMPKα1敲除小鼠體增重、血液指標、肝臟和脂肪組織脂肪沉積的影響；在此基礎上,利用knockdown AMPKα1、激活或抑制AMPK活性以及利用甲基化抑制劑等方法,在體外細胞試驗中,深入探討了三甲基甘氨酸通過激活AMPK通路來緩解動物機體脂肪沉積的可能機制。主要研究結果如下：試驗一：三甲基甘氨酸對高脂誘導的小鼠體增重和血液指標的影響本試驗構建了AMPKα1敲除小鼠模型,并對比研究了三甲基甘氨酸對高脂誘導的野生型和AMPKα1敲除小鼠體增重、血脂水平和與脂肪代謝相關激素水平的影響。體增重：野生型和AMPKα1敲除小鼠的體增重無顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導顯著提高了體增重(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則緩解了高脂誘導的體增重增加(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導也顯著提高了體增重(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸對高脂誘導的體增重增加無緩解作用；血液甘油三酯和游離脂肪酸：野生型和AMPKα1敲除小鼠血液中甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)水平無顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導顯著提高了血液中TG和FFA水平(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則緩解了高脂誘導的TG和FFA水平升高(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導也顯著提高了血液中TG和FFA水平(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸對高脂引起的TG和FFA水平變化無緩解作用。脂肪代謝相關激素水平：野生型和AMPKα1敲除小鼠血液中胰島素和瘦素水平無顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導顯著提高了血液中胰島素和瘦素水平(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸則顯著緩解了高脂誘導的胰島素和瘦素水平升高(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導也顯著提高了血液中胰島素和瘦素水平(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸對高脂誘導的激素水平變化無緩解作用。以上結果提示三甲基甘氨酸可降低小鼠體增重、降低血脂和激素水平,且AMPKα1在三甲基甘氨酸發(fā)揮這些作用過程中起關鍵作用。試驗二：三甲基甘氨酸對高脂誘導小鼠機體脂肪沉積的影響及初步機制研究在上述體重和血液指標研究的基礎上,進一步研究了三甲基甘氨酸對高脂誘導的野生型和AMPKα1敲除小鼠脂肪沉積的影響,結果如下：在肝臟組織脂肪沉積方面：組織切片油紅O染色顯示：野生型和AMPKα1敲除小鼠肝臟脂肪沉積無差異；在野生型小鼠中,高脂誘導提高了肝臟脂肪沉積,而高脂組加入三甲基甘氨酸則緩解了高脂誘導的肝臟脂肪沉積；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導也提高了肝臟脂肪沉積,但高脂組加入三甲基甘氨酸對高脂誘導的肝臟脂肪沉積無降低作用。線粒體功能和脂肪酸氧化：野生型和AMPKα1敲除小鼠肝臟線粒體功能(PGC1α)和脂肪酸氧化(CPT1a)相關蛋白表達無顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導顯著降低了肝臟PGC1α和CPT1a蛋白表達(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則顯著提高了PGC1α和CPT1a蛋白表達(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導也顯著降低了肝臟PGC1α和CPT1a蛋白表達(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸提高了PGC1α和CPT1a蛋白表達(P0.05)。本試驗室前期研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化水平與脂肪沉積成正相關,而三甲基甘氨酸是重要的甲基供體,因此我們進一步檢測了肝臟中m6A甲基化水平以及去甲基化酶FTO蛋白表達：野生型和AMPKα1敲除小鼠肝臟FTO蛋白表達和m6A甲基化水平無顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導顯著提高了肝臟FTO蛋白表達(P0.05),降低了m6A甲基化水平(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸顯著緩解了高脂誘導的FTO蛋白表達和m6A甲基化的變化(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導也顯著提高了肝臟FTO蛋白表達(P0.05),降低了m6A甲基化水平(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸顯著緩解了高脂引起的m6A甲基化和FTO蛋白表達的變化(P0.05)。在附睪脂肪組織脂肪沉積方面：附睪脂肪組織含量：野生型和AMPKα1敲除小鼠附睪脂肪組織含量無顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導顯著提高附睪脂肪組織含量(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則顯著緩解了高脂誘導的附睪脂肪組織含量的增加(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導也顯著提高了附睪脂肪組織含量(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸則對高脂誘導的附睪脂肪組織含量的增加無緩解作用。線粒體功能和脂肪酸氧化：野生型和AMPKα1敲除小鼠附睪脂肪組織PGC1α和CPT1a蛋白表達無顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導顯著降低了附睪脂肪組織PGC1α和CPT1a蛋白表達(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則顯著提高了PGC1α和CPT1a蛋白表達(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導也顯著降低了PGC1α和CPT1α蛋白表達(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸對PGC1α和CPT1a蛋白表達無顯著影響。FTO蛋白表達和m6A甲基化：野生型和AMPKα1敲除小鼠附睪脂肪組織FTO蛋白表達和m6A甲基化水平無顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導顯著提高了FTO蛋白表達(P0.05),降低m6A甲基化水平(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則顯著緩解了高脂引起的FTO蛋白表達和m6A甲基化水平的變化(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導也顯著提高FTO蛋白表達(P0.05),降低m6A甲基化水平(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸對高脂引起的m6A甲基化和FTO蛋白表達無顯著影響。以上結果提示三甲基甘氨酸顯著降低肝臟和附睪脂肪組織的脂肪沉積,顯著提高肝臟和附睪脂肪組織線粒體功能、脂肪酸氧化和m6A甲基化水平,且AMPKα1在三甲基甘氨酸發(fā)揮這些作用過程中起關鍵作用。試驗三：三甲基甘氨酸降低脂肪細胞脂肪沉積的AMPK機制研究在上述體內(nèi)試驗初步證明了AMPKα1在三甲基甘氨酸降低脂肪沉積的作用中起關鍵作用,在此基礎上,本試驗利用分離得到的小鼠附睪脂肪細胞,進一步通過體外試驗驗證三甲基甘氨酸通過激活AMPK通路來降低脂肪組織脂肪沉積的可能機制。在脂肪細胞中knockdown AMPKα1:三甲基甘氨酸可以顯著降低脂肪細胞的脂肪沉積,提高脂肪細胞CPT1α釉PGC1α蛋白表達和m6A甲基化水平(P0.05)；但knockdown AMPKα1后,三甲基甘氨酸對脂肪細胞的脂肪沉積,CPT1a, PGC1α和FTO蛋白表達以及m6A甲基化水平均無顯著影響(P0.05)。在脂肪細胞中激活或抑制AMPK活性：為進一步探究AMPK和m6A甲基化的關系,在脂肪細胞中激活AMPK顯著降低了FTO蛋白表達水平(P0.05),顯著提高了脂肪細胞m6A甲基化水平(P0.05)；但抑制AMPK對m6A甲基化和FTO蛋白表達水平無顯著影響(P0.05)。在脂肪細胞中抑制甲基化反應：為進一步了解甲基化反應是否是三甲基甘氨酸發(fā)揮作用的重要途徑之一,利用Neplanocin A (NPA)處理脂肪細胞發(fā)現(xiàn)抑制甲基化反應后,脂肪細胞mRNA m6A甲基化水平顯著降低(P0.05)；三甲基甘氨酸顯著降低了脂肪細胞脂肪沉積(P0.05),但抑制甲基化反應后,三甲基甘氨酸對脂肪細胞脂肪沉積無顯著影響(P0.05)。以上結果提示三甲基甘氨酸可能是通過激活AMPK活性,降低FTO表達,提高m6A甲基化水平來降低脂肪細胞脂肪沉積,AMPKα1在其中起關鍵作用。綜上所述,三甲基甘氨酸可以激活AMPKα1,進一步提高脂肪酸氧化,線粒體功能以及m6A甲基化水平,從而發(fā)揮降低體脂沉積的作用。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S816

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