【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是來源于中胚層的成體干細胞之一,能夠分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞等細胞類型,因此,其常作為組織再生的重要的細胞來源之一。然而,目前對BMSCs定向分化分子機制的研究仍然存在疑問,不清楚有哪些因素影響了其分化潛能。最近的研究發(fā)現(xiàn),Homeobox(HOX)基因參與了BMSCs的增殖、凋亡和分化的調(diào)節(jié)過程。本研究通過分離綿羊BMSCs(sBMSCs)、構(gòu)建HOXC10的過表達載體及干擾載體,將兩種載體利用電轉(zhuǎn)染的方法分別轉(zhuǎn)入sBMSCs中,觀察HOXC10對sBMSCs增殖、凋亡的影響。在此基礎(chǔ)上分別對sBMSCs進行成脂誘導(dǎo)及成骨誘導(dǎo),通過油紅O染色、脂滴定量檢測、茜素紅染色、骨鈣素定量分析,以及對成脂、成骨相關(guān)基因在mRNA及蛋白水平的表達情況檢測,研究HOXC10在sBMSCs成脂及成骨分化過程中的功能及其對分化潛能的影響。利用細胞貼壁法分離sBMSCs,通過傳代、免疫熒光觀察以及細胞誘導(dǎo)檢測其干細胞特性,結(jié)果表明已成功分離sBMSCs。同時,通過基因片段PCR、連接、酶切等方法成功構(gòu)建了HOXC10的過表達載體及干擾載體。220V、2.5ms條件下對sBMSCs進行電轉(zhuǎn)染,在電轉(zhuǎn)染48h后進行效率檢測,發(fā)現(xiàn)HOXC10過表達載體轉(zhuǎn)入sBMSCs后HOXC10表達量較于對照組升高371.68倍,而轉(zhuǎn)染干擾載體的sBMSCs中HOXC10表達量相較于對照組降低了80.38%,表明構(gòu)建的兩個載體為有效載體。電轉(zhuǎn)染后的sBMSCs培養(yǎng)24h、48h、72h后分別加入CCK8(Cell Counting Kit-8),并于450nm處檢測吸光度值,發(fā)現(xiàn)HOXC10的過表達會促進細胞的生長,HOXC10的干擾會抑制細胞生長。通過流式細胞儀檢測HOXC10對于sBMSCs凋亡情況的影響發(fā)現(xiàn):HOXC10過表達會抑制sBMSCs凋亡,而干擾HOXC10則能促進sBMSCs凋亡。分別將轉(zhuǎn)入HOXC10過表達和干擾載體的sBMSCs在成脂誘導(dǎo)3d、6d、12d、18d后通過油紅O染色、脂滴定量檢測、觀察其脂滴形成情況,同時利用qPCR、Western Blot及灰度分析對成脂誘導(dǎo)相關(guān)基因LPL、PPARG、Fabp4、ACC的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及LPL、PPARG的蛋白表達水平進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOXC10過表達對于成脂誘導(dǎo)具有促進作用,干擾HOXC10能抑制成脂過程。同時,分別將轉(zhuǎn)入HOXC10過表達和干擾載體的sBMSCs在成骨誘導(dǎo)3d、7d、11d、14d通過茜素紅染色、鈣結(jié)節(jié)定量檢測觀察其鈣結(jié)節(jié)形成情況,并通過qPCR、Western Blot以及灰度分析檢測成骨誘導(dǎo)相關(guān)基因COLIA1、BMP5、Runx2、OPN的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及Runx2、OPN的蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)HOXC10基因過表達及干擾對于sBMSCs成骨沒有明顯的作用。本研究結(jié)果表明,HOXC10過表達對sBMSCs的增殖起促進作用、對其凋亡起抑制作用,同時能促進成脂。反之,HOXC10干擾則能抑制sBMSCs增殖,促進其凋亡、對成脂起抑制作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)HOXC10表達量的變化對sBMSCs成骨沒有明顯的作用。以上實驗研究為今后深入研究HOXC10在BMSCs分化過程中的功能及其對分化潛能的作用機制提供了實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S826
【圖文】：

圖 1.1 HOX 基因簇進化情況[10]Figure 1.1 Genesis and evolution of HOX clusters物的同源盒基因共分為兩類：一類為成簇排列在染進行表達的 I 類同源盒基因（A-P 型），也被稱為 特異性；另一類是與 HOX 基因有高度的序列同一性為散在 Homeobox 基因，研究人員普遍認為這些基多數(shù)的基因獨立散布在不同染色體上。這些散在 H能，還執(zhí)行其它功能，其中部分散在 Homeobox 基普遍認為這類 ParaHOX 基因本質(zhì)上是 HOX 基因在集群。另外，HOX 基因還存在一種親緣關(guān)系更加疏稱為 NK 簇。比較基因組學(xué)研究表明 NK 簇、HOX 和且具有進化相關(guān)性，但三者在胚胎發(fā)育過程中的表

圖 3.1 原代 sBMSCs 形態(tài)（4×）A：第 6 天 sBMSCs 形態(tài) B：第 9 天 sBMSCs 形態(tài)Figure 3.1 Morphology of primary sBMSCs (4×)A: Morphology of 6d sBMSCs B: Morphology of 9d sBMSCs 代 sBMSCs 的復(fù)蘇后形態(tài) 3.2 分別為 sBMSCs P2 細胞解凍 4h、24h、48h、72h 的細胞形態(tài)。從圖上可以 sBMSCs 在解凍 4h 后已經(jīng)完成貼壁，細胞形態(tài)多趨近于圓形。解凍 24h 后可，多為長梭形或長多邊形，這是典型的 BMSCs 細胞形態(tài)。細胞數(shù)隨培養(yǎng)時間，由于細胞間接觸越來越緊密，細胞形態(tài)接近于短梭形，在 72h 細胞匯合度已接傳代或下一步實驗操作。

圖 3.2 P2 sBMSCs 的復(fù)蘇后形態(tài)（4×）A：復(fù)蘇 4h 后 sBMSCs 形態(tài) B：復(fù)蘇 24h 后 sBMSCs 形態(tài)C：復(fù)蘇 48h 后 sBMSCs 形態(tài) D：復(fù)蘇 72h 后 sBMSCs 形態(tài)igure 3.2 Morphology of post-recovery P2 generation sBMSCs（4×）logy of sBMSCs after 4h recovery B: Morphology of sBMSCs after 24h rlogy of sBMSCs after 48h recovery D: Morphology of sBMSCs after 72h r熒光鑒定

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本文編號：2778140