【摘要】：哺乳動物早期胚胎發(fā)育起始于受精卵的形成,經(jīng)數(shù)次卵裂形成具有植入能力的囊胚,這一過程所涉及到的細胞分裂模式在不同物種間具有高度保守性,但各物種在該過程中轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控規(guī)律卻有很大差別。目前,關(guān)于早期胚胎發(fā)育的研究主要聚焦在人和小鼠上,而在豬上卻十分欠缺。豬不僅是必不可少的經(jīng)濟動物,也是應(yīng)用前景廣闊的醫(yī)療模型。為了解析由卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)得到的豬早期胚胎發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組的變化規(guī)律、挖掘調(diào)控該過程的關(guān)鍵基因、評估豬和其他物種間早期胚胎發(fā)育過程的保守性并探尋體細胞核移植技術(shù)(somatic cell nuclear transfer,SCNT)效率偏低的分子機制,本研究基于單細胞測序技術(shù),對分別利用SCNT技術(shù)和ICSI技術(shù)得到的兩組豬植入前各時期胚胎的轉(zhuǎn)錄組進行系統(tǒng)分析。本研究以ICSI組胚胎為對照組,研究豬早期胚胎發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組的變化規(guī)律,并和其他物種進行保守性分析,最后挖掘潛在導(dǎo)致SCNT技術(shù)效率低下的關(guān)鍵基因。主要結(jié)果如下:(1)在ICSI組胚胎發(fā)育過程中,合子基因組激活(zygote genome activation,ZGA)事件是一個連續(xù)過程,在由合子發(fā)育成囊胚的各個過程中均存在,其最大變化發(fā)生在由4細胞向8細胞發(fā)育的時期,在該時期激活的基因主要在轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)及mRNA加工等方面發(fā)揮作用。(2)在ICSI組相鄰時期間共鑒定得到9931個差異表達的蛋白編碼基因(differentially expressed gene,DEG),表明在胚胎早期發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了很大變化。聚類分析結(jié)果表明絕大多數(shù)DEGs均具有十分明顯的時期特異性表達模式。其中,在8細胞期開始上調(diào)表達的基因多在轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控方面發(fā)揮作用,而在囊胚期特異表達的基因則主要在物質(zhì)和能量代謝方面發(fā)揮作用。(3)在ICSI組和SCNT組胚胎發(fā)育的各個時期,鑒定出數(shù)量差別很大的可變剪切基因,發(fā)現(xiàn)在各個時期均表達的可變剪切基因主要發(fā)揮一些基礎(chǔ)的功能,如RNA剪切和細胞周期等。分析還發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)可變剪切基因主要通過1到2個主效轉(zhuǎn)錄本來發(fā)揮作用。對ICSI組主要ZGA時期組間特異表達的轉(zhuǎn)錄本進行分析,發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)的基因大多富集到與RNA形成相關(guān)的生物學(xué)過程。(4)鑒定得到88711個多聚腺苷酸化位點(polyadenylation site,PAS),各時期樣品中PAS數(shù)量差別極大。分析發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)PAS數(shù)量和其表達量及可變剪切數(shù)量均呈弱相關(guān)。對ICSI組主要ZGA時期組間具有不同利用率PAS的基因進行功能富集,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因在mRNA產(chǎn)生和加工等方面發(fā)揮作用。(5)鑒定得到66619個高置信度的基因間長鏈非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA,lincRNA),其中18612個lincRNAs是新鑒定得到的。在ICSI組和SCNT組中均鑒定得到大量相鄰時期間差異表達的lincRNA,且這些lincRNA具有明顯的時期特異性表達模式。功能預(yù)測結(jié)果表明不同時期特異表達的lincRNA通常具有不同的生物學(xué)功能。核心lincRNA分析結(jié)果表明red模塊(4細胞期)中的核心lincRNAs主要在轉(zhuǎn)錄起始方面發(fā)揮功能,而salmon模塊(囊胚期)中的核心lincRNAs則主要在物質(zhì)代謝方面發(fā)揮作用。(6)母系基因在不同物種早期胚胎發(fā)育過程中的保守性要強于合子基因。豬和人之間保守的母系基因數(shù)量多于小鼠和人,同時少于猴和人之間保守的母系基因。豬和人之間保守的合子基因數(shù)量最多,顯著多于小鼠和人以及猴和人之間保守的合子基因。此外,豬和人早期胚胎發(fā)育各個時期內(nèi)基因的表達情況較為相似,而猴和小鼠與豬之間的基因表達相似性則處于較低水平。(7)SCNT組胚胎發(fā)育過程中,轉(zhuǎn)錄組的最大變化發(fā)生在由桑椹胚向囊胚發(fā)育的階段,晚于ICSI組胚胎。SCNT組4細胞期和8細胞期胚胎表達的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量、可變剪切基因數(shù)量及基因總數(shù)均低于ICSI組相應(yīng)時期。在SCNT組和ICSI組相同時期間共鑒定得到6080個DEGs,其中在8細胞期DEGs數(shù)量最多,囊胚期次之,這些DEGs主要在RNA加工運輸、脂質(zhì)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮作用。(8)SCNT組合子期至4細胞期胚胎的轉(zhuǎn)錄組和ICSI組相應(yīng)時期胚胎轉(zhuǎn)錄組相似性較高,而在8細胞期和桑椹胚期的轉(zhuǎn)錄組則和ICSI組的合子期至4細胞期的轉(zhuǎn)錄組較為相似。在SCNT組囊胚期,28.6%的特異表達的基因在ICSI組合子期至桑椹胚期已經(jīng)上調(diào)表達。對375個胚胎發(fā)育相關(guān)的核心基因進行分析,結(jié)果表明41.9%的基因在SCNT組和ICSI組同一時期胚胎之間差異表達。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S828
【圖文】：

圖 1-1 豬早期胚胎發(fā)育模式圖源于網(wǎng)絡(luò)：https://www.qunfengshe.com/articles/QXJ0aWNsZToFig. 1-1 Schematic graph of pig early embryo developmentThe graph was downloaded from Internet(https://www.qunfengshe.com/articles/QXJ0aWNsZToxNDA=).胚胎發(fā)育相關(guān)的研究進展胚胎發(fā)育是一個十分復(fù)雜的連續(xù)性生理過程，其中涉及大子物質(zhì)，而這些物質(zhì)又需要龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來協(xié)調(diào)彼此之的正常發(fā)育。目前，關(guān)于豬早期胚胎發(fā)育的研究相較于小是廣度上均遠遠落后。由于物種的特殊性，與豬早期胚胎因或培養(yǎng)環(huán)境對卵母細胞體外成熟率、體外囊胚發(fā)育率和影響等方面，另外有部分研究是關(guān)于特定基因在胚胎發(fā)育些年高通量測序技術(shù)的發(fā)展和實驗技術(shù)的進步，使得越來

圖 1-2 SCNT 技術(shù)流程圖Fig. 1-2 Workflow for SCNTNT 技術(shù)以一種全新的生殖方式，不經(jīng)過精卵融合而產(chǎn)生出基因型與親代，在動物育種、醫(yī)學(xué)研究和生物工程等研究領(lǐng)域帶來了巨大的變革面，研究人員結(jié)合基因編輯技術(shù)可以獲得具有改良性狀的新品種。2017 Burkard C 團隊通過基因編輯敲除豬合子中編碼豬繁殖與呼吸障礙的 CD163 基因的第 7 外顯子，最終生產(chǎn)出對該疾病免疫的新品種，產(chǎn)業(yè)成本 Burkard et al. 2017 。在醫(yī)學(xué)研究方面，研究人員可以人類疾病模型，便于后續(xù)研究。目前，用于研究亞急性壞死性腦病的失模型豬 Quadalti et al. 2018 和用于研究侏儒綜合征的生長激素）修飾模型豬 Yu et al. 2018a 均已成功建立。在生物工程領(lǐng)域，克物反應(yīng)器，批量化地生產(chǎn)醫(yī)用蛋白。2015 年，張普民教授和魏泓教基因組編輯工具將人血白蛋白 cDNA 敲入豬基因組，獲得了重組人

Fig. 1-3 Genomic location and context of lncRNAs表 1-1 LncRNA 分類 St Laurent et al. 2015Table 1-1 Different classes of lncRNAs分類標準 類別長度 Large intervening noncoding RNAVery long intergenic noncoding RMacroRNA功能的 DNA 元件之間的聯(lián)系 Enhancer-associated RNAPromoter-associated long RNAUpstream antisense RNAPromoter uPstream TranscriptTelomeric repeat-containing RNA功能 miRNAprimary transcriptspiRNA primary transcripts

【參考文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 張志人;豬體細胞核移植早期胚胎的合子基因激活及表觀遺傳修飾的研究[D];吉林大學(xué);2018年

2 張恒;L1-siRNAs在豬早期胚胎中的功能研究及豬早期胚胎單細胞轉(zhuǎn)錄組分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 劉玉勝;母源BTG4在小鼠早期胚胎發(fā)育中的功能和機制研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2017年

本文編號：2775408