【摘要】：雞球蟲病是由幾種艾美耳球蟲寄生雞腸道引起的一種危害極其嚴(yán)重的全球性寄生蟲病,柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)是雞球蟲病的主要致病蟲株,本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)E.tenella鈣依賴蛋白激酶3(calcium-dependent protein kinases 3,EtCDPK3)與蟲體入侵宿主細(xì)胞有關(guān)。本研究利用免疫共沉淀(Co-IP)聯(lián)合質(zhì)譜分析篩選可能與EtCDPK3互作的蛋白,對篩選出的E.tenella二磷酸核苷激酶(EtNDK)和實驗室前期篩選的E.tenella保守蛋白(EtCHP)進(jìn)行驗證。同時對E.tenella鋅指蛋白(EtZN1-ZnFP)和保守蛋白(EtCHP)的特性進(jìn)行分析,并評價了它們的免疫保護(hù)效果。1.Co-IP聯(lián)合質(zhì)譜篩選柔嫩艾美耳球蟲EtCDPK3相互作用蛋白純化E.tenella子孢子并提取總蛋白,采用Co-IP技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜進(jìn)行篩選和定性分析。共篩選出單克隆抗體組145個、單克隆抗體陰性對照組167個、多克隆抗體組227個、多克隆抗體陰性對照組189個潛在蛋白。整理數(shù)據(jù)獲得6個可能與EtCDPK3相互作用的蟲體蛋白,包括ATP合成酶γ鏈、葡萄糖磷酸變位酶1、二磷酸核苷激酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶和2個未知保守蛋白。2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建及互作蛋白的驗證本研究分別構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-Et CHP和pET-28a-EtNDK以及真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-flag-EtCHP和pBiFC-VC155-EtNDK。分別利用His Pull-down和BiFC對EtNDK與EtCDPK3的互作進(jìn)行了驗證。同時,利用GST Pull-down與Co-IP對EtCHP與EtCDPK3的互作進(jìn)行了驗證。結(jié)果顯示EtNDK與EtCDPK3之間不存在相互作用,EtCHP與EtCDPK3之間也不存在相互作用。3.柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP和鋅指蛋白EtZN1-ZnFP功能的初步分析PCR擴(kuò)增獲得EtCHP和EtZN1-ZnFP基因的ORF序列。熒光定量PCR顯示EtCHP在子孢子階段轉(zhuǎn)錄水平最高,EtAN1-ZnFP在未孢子化卵囊和子孢子階段轉(zhuǎn)錄水平較高。Western blot檢測結(jié)果顯示二者均有較好地反應(yīng)原性。間接免疫熒光顯示EtCHP主要分布于子孢子和第二代裂殖子表面;EtAN1-ZnFP均勻分布在子孢子和未成熟裂殖體的細(xì)胞質(zhì)中。體外入侵抑制結(jié)果顯示,anti-rEtCHP的入侵抑制率最高可達(dá)28%,anti-rEtAN1-ZnFP的最高入侵抑制率約為30%。4.柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP和鋅指蛋白EtZN1-ZnFP的免疫保護(hù)實驗分別用rEtCHP和rEtZN1-ZnFP免疫雛雞進(jìn)行免疫保護(hù)實驗。結(jié)果顯示,與未免疫組相比,重組蛋白免疫的雞病變計分和糞便卵囊產(chǎn)量顯著降低。ELISA檢測雞血清中的IgG和細(xì)胞因子顯示,IgG水平顯著高于未免疫攻蟲對照組。與未免疫對照組相比,二免7日后血清中除了分化抗原簇8,其他細(xì)胞因子變化不明顯。但在攻蟲后9日,與未免疫攻蟲對照組相比,rEtZN1-ZnFP/ISA71(50ug/只)免疫組分化抗原簇4水平顯著升高;rEtZN1-ZnFP兩個免疫組分化抗原簇8水平都顯著升高;rEtCHP兩個免疫組IL-17和TGF-β1水平顯著高于攻蟲未免疫對照組。以上結(jié)果表明,rEtCHP和rEtZN1-ZnFP對抵抗E.tenella感染發(fā)揮了一定的作用。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.723
【圖文】：

比樣品組與對照組，找出兩組之間的差異條帶。將剩司進(jìn)行質(zhì)譜定性分析，以獲得差異蛋白條帶的生物信分析ant 軟件）原始數(shù)據(jù)，獲得結(jié)果。蟲子孢子的收集與純化雛雞（2 周齡），收集接種后 6-8 d 的糞便，收集卵囊用飽和食鹽水漂浮法和次氯酸鈉氧化法純化后得到孢，經(jīng)胰蛋白酶和雞膽汁消化、G3 砂芯漏斗過濾后收

圖 2.2 子孢子全蛋白的 SDS-PAGEFig.2.2 SDS-PAGE analysis of sporozoite M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：子孢子全Protein molecular weight Marker; 1: Sporoz SDS-PAGE 分析noprecipitation Kit 試劑盒進(jìn)行 Co-I子孢子總蛋白與樹脂一起孵育，洗入 5 μL5×SDS-PAGE 上樣緩沖液，體組（Mb）、單克隆抗體陰性對照b-N）。結(jié)果顯示，分別與各自的陰圖 2.3）。

圖 2.3 免疫共沉淀洗脫液 SDS-PAGE 分析ig.2.3 SDS-PAGE analysis of co-immunoprecipitation p；1：單克隆抗體組；2：單克隆抗體陰性對照組；3：性對照組t Marker; 1: Monoclonal antibody group; 2: Monoclonaclonal antibody group; 4: Polyclonal antibody negative 分析獲得潛在互作蛋白進(jìn)行 ESI 質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果如表 2.2。共篩Pb-N 組 189 個潛在蛋白。將篩選獲得的數(shù)的，初步篩選獲得 6 個可能與 EtCDPK3 相互 合成酶 γ 鏈（ATP synthase gama chaiparafusin related protein 1，PGM1）、二磷酸核苷葡糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehydro

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