發(fā)布時(shí)間：2020-07-26 12:41

【摘要】：片形吸蟲(chóng)的兩個(gè)致病種大片形吸蟲(chóng)和肝片形吸蟲(chóng)均能感染人和哺乳動(dòng)物引起片形吸蟲(chóng)病,不同宿主的易感性不同,這與片形吸蟲(chóng)對(duì)宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控或逃避有關(guān)。肝片形吸蟲(chóng)及其ESP已被證實(shí)能誘導(dǎo)小鼠和牛巨噬細(xì)胞的M2型極化,而大片形吸蟲(chóng)在宿主中能否引起相似的免疫反應(yīng)尚無(wú)明確的結(jié)論。本研究旨在通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)探討大片形吸蟲(chóng)及其ESP在不同宿主引起的巨噬細(xì)胞極化和固有免疫反應(yīng)的差異及其免疫機(jī)制,并將淋巴插管模型應(yīng)用于片形吸蟲(chóng)ESP對(duì)宿主免疫細(xì)胞的作用研究,以探明片形吸蟲(chóng)及其ESP對(duì)宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制,為理解大片形吸蟲(chóng)與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用提供可靠的理論基礎(chǔ)。本研究取得以下成果:1.用大片形吸蟲(chóng)囊蚴感染水牛、昆明小鼠(KM)和C57BL/6Nju小鼠(B6),分別于水牛感染后4周、10周、14周和小鼠感染后3周、4周、7或8周處死。通過(guò)肝組織切片觀察到水牛和小鼠肝臟均能從炎癥浸潤(rùn)向結(jié)締組織增生轉(zhuǎn)歸,水牛感染14周可見(jiàn)肝內(nèi)肉芽組織和成蟲(chóng)形成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝臟枯否細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)分子標(biāo)志和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量,并用ELISA檢測(cè)血清IFN-γ和IL-4,結(jié)果顯示:隨著感染病程的加劇水�？莘窦�(xì)胞表型從M2型極化向M1、M2型共上調(diào)的趨勢(shì)轉(zhuǎn)變,KM小鼠枯否細(xì)胞表型則由前期的M1+M2混合型向M0型轉(zhuǎn)歸,而B(niǎo)6小鼠則表現(xiàn)為更明顯的M2型極化。結(jié)果表明:大片形吸蟲(chóng)感染水牛和小鼠可誘導(dǎo)肝臟KC表型和細(xì)胞因子的表達(dá)變化存在較大宿主差異,這些變化的宿主差異是與不同宿主肝臟的載蟲(chóng)能力、損傷修復(fù)能力、病變程度以及蟲(chóng)體在宿主體內(nèi)移行、發(fā)育密切相關(guān)的。2.用大片形吸蟲(chóng)分泌排泄產(chǎn)物200μg FgESP腹腔注射KM小鼠和B6小鼠,4天、7天隔日注射作為短期試驗(yàn)組,14周每周注射作為長(zhǎng)期試驗(yàn)組,注射PBS為對(duì)照。通過(guò)肝組織切片觀察到FgESP腹腔短期注射不會(huì)引起小鼠肝臟明顯的組織學(xué)變化,而長(zhǎng)期注射會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加、結(jié)締組織增生和纖維化趨勢(shì)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝臟枯否細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)分子標(biāo)志和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量,結(jié)果顯示:KM小鼠短期注射FgESP會(huì)引起肝組織iNOSmRNA表達(dá)下調(diào),但B6小鼠CD206、Arg-2、YM-1的表達(dá)上調(diào),兩種小鼠枯否細(xì)胞均表現(xiàn)出M2型極化優(yōu)勢(shì);兩種小鼠長(zhǎng)期注射FgESP則引起完全不同的KCs表型趨勢(shì),其中KM小鼠表現(xiàn)為M1和M2型同時(shí)上調(diào)的混合型,B6則表現(xiàn)為M1和M2均沒(méi)變化的M0型。3.用200 gg/mL大片形吸蟲(chóng)分泌排泄產(chǎn)物FgESP體外刺激水牛原代BLMΦ和B6小鼠來(lái)源的傳代iPMΦ(野生型)兩類(lèi)MΦ48小時(shí)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定兩類(lèi)巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)志和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量,化學(xué)法測(cè)定細(xì)胞Arg-1,Griess法測(cè)定細(xì)胞上清NO濃度,ELISA測(cè)定上清IFN-γ、IL-4濃度,結(jié)果顯示:水牛BLMΦCD68基因表達(dá)下調(diào)、Arg-2基因表達(dá)上調(diào),Arg-1、NO的合成增加,上清中的IFN-γ濃度下降、IL-4沒(méi)有明顯變化,提示可能存在M2型極化和細(xì)胞激活的抑制或凋亡的發(fā)生;小鼠野生型iPMΦA(chǔ)rg-1合成增加,上清中的IL-4濃度顯著升高,而IFN-γ、NO濃度沒(méi)有變化,也提示M2型極化。結(jié)果表明:FgESP體外刺激不同宿主MΦ均能誘導(dǎo)M2型極化。4.用2000μg/mL FgESP分別體外刺激B6小鼠來(lái)源的基因敲除iPMΦ(MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-、TLR-2/4-/-),測(cè)定上清NO、IFN-γ、IL-4濃度和細(xì)胞裂解物的Arg-1含量,并與野生型iPMΦ進(jìn)行比較,結(jié)果顯示:MyD88的缺失導(dǎo)致IL-4的分泌與對(duì)照組無(wú)差異,而MyD88、TRIF同時(shí)缺失導(dǎo)致IL-4的分泌減少,兩者均低于野生型iPMΦ;無(wú)論是MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-還是TLR-2/4-/-iPMΦ,FgESP體外刺激誘導(dǎo)的Arg-1產(chǎn)量均與對(duì)照組無(wú)差異。結(jié)果表明:FgESP體外刺激小鼠傳代巨噬細(xì)胞能誘導(dǎo)依賴(lài)于MyD88及其相關(guān)通路的M2型激活,促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子分泌,促進(jìn)Arg-1合成和NO分泌抑制,而TRIF和TLR2、TLR4也有可能以某種方式發(fā)揮作用。5.通過(guò)外科手術(shù)成功構(gòu)建綿羊的股骨前偽輸入淋巴插管、肝臟輸入淋,巴插管,成功率分別為約70%和33%左右。6.將200μg熒光標(biāo)記的肝片形吸蟲(chóng)分泌排泄產(chǎn)物FhESP于綿羊股骨前區(qū)域多點(diǎn)皮下注射(OVA設(shè)為對(duì)照抗原),并通過(guò)股骨前偽輸入淋巴插管收集0～7天不同時(shí)間點(diǎn)的淋巴液并分離免疫細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析免疫細(xì)胞種類(lèi)和抗原吞噬細(xì)胞的比例,熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)志mRNA表達(dá)量,ELISA測(cè)定淋巴液的IFN-γ和IL-4,結(jié)果顯示:FhESP注射刺激能使股骨前輸入淋巴中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的比例分別在注射后4～8小時(shí)和8～12小時(shí)特異性升高,淋巴細(xì)胞的比例在注射后4～8小時(shí)特異性降低,DCs的比例在注射后4～8小時(shí)升高但與OVA對(duì)照抗原相比缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的比例在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯改變;抗原吞噬細(xì)胞的數(shù)量在注射后4～12h的短暫提高,其中,嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)FhESP的早期吞噬具有特異性,但DCs的兩個(gè)亞群的比例變化不具抗原特異性;FhESP刺激能導(dǎo)致淋巴液分離到的細(xì)胞M2型分子標(biāo)志CD206、Arg-2和YM-1的表達(dá)均在刺激后24小時(shí)內(nèi)特異性上調(diào),淋巴液IL-4在0～8h特異性升高,IFN-γ、IL-10、IL-12的含量沒(méi)有特異性變化。結(jié)果表明:綿羊股骨前偽輸入淋巴插管操作簡(jiǎn)單,成功率高,適用于免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn),通過(guò)該模型我們發(fā)現(xiàn)FhESP能在綿羊體內(nèi)促進(jìn)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的快速招募,提高吞噬細(xì)胞抗原吞噬能力,特異性誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化和Th2細(xì)胞因子分泌。綜上所述,本文認(rèn)為大片形吸蟲(chóng)感染導(dǎo)致肝臟枯否細(xì)胞表型極化趨勢(shì)和細(xì)胞免疫應(yīng)答趨勢(shì)存在較大的宿主差異,主要取決于宿主肝臟的載蟲(chóng)能力、損傷修復(fù)能力和病變進(jìn)程。大片形吸蟲(chóng)分泌排泄產(chǎn)物FgESP則能在體、內(nèi)外誘導(dǎo)動(dòng)物宿主巨噬細(xì)胞依賴(lài)于MyD88信號(hào)通路的M2型極化,并刺激分泌Th2型細(xì)胞因子,通過(guò)上調(diào)Arg-1抑制NO分泌降低巨噬細(xì)胞清除病原的能力,可能是大片形吸蟲(chóng)逃避巨噬細(xì)胞免疫殺傷的策略。此外,在綿羊身上成功構(gòu)建并應(yīng)用偽輸入淋巴插管模型研究肝片形吸蟲(chóng)分泌排泄產(chǎn)物FhESP對(duì)宿主免疫細(xì)胞的作用,發(fā)現(xiàn)FhESP具有早期招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞、提高吞噬細(xì)胞早期抗原吞噬、誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞和Th2型細(xì)胞免疫的能力。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.7
【圖文】：

邐■泄對(duì)巨答作用究逡逑的不同（分別為促炎和抗炎）。１＾３１？（＾３１１丨１８９］根據(jù)誘導(dǎo)物和功能不同，將Ｍ２ＭＯ進(jìn)一步逡逑分為ａ、ｂ、ｃ三個(gè)亞群（圖１－１）。其中，Ｍ２ａ誘導(dǎo)物為ＩＬ－４和ＩＬ１３，表現(xiàn)為抗寄生蟲(chóng)逡逑和組織修復(fù)，即典型的Ｍ２Ｍｄ＞；邋Ｍ２ｂ誘導(dǎo)物為ＩＬ－１Ｒ／ＴＬＲ配體和免疫復(fù)合物如ＬＰＳ和逡逑１Ｃ，可產(chǎn)生細(xì)胞毒分子并保護(hù)宿主免受內(nèi)毒素毒性，也稱(chēng)ｔｙｐｅ邋ＩＩ邋ＭＯ；邋Ｍ２ｃＭ０＞刺激物逡逑為ＴＧＦ－ｐ、ＩＬ－１０和ＧＣ，可能涉及異源Ｍ＜Ｄ失活【９Ｑ】。Ｍ２ａＭＯ、Ｍ２ｃＭ￥均表現(xiàn)為抗炎逡逑效應(yīng)；Ｍ２ｂＭ０＞則類(lèi)似Ｍ１Ｍ＜Ｄ，能分泌高水平的促炎癥因子，但仍具有Ｍ２Ｍ０＞的表型逡逑特征【８９】，對(duì)炎癥進(jìn)行抑制或負(fù)調(diào)控。有意思的是，組學(xué)研宄發(fā)現(xiàn)Ｍ１Ｍ０極化會(huì)造成轉(zhuǎn)逡逑錄組的明顯變化，而Ｍ２Ｍ０極化對(duì)轉(zhuǎn)錄組影響甚微［８９，９１］。有研宄稱(chēng)Ｍ２ＭＯ可能與內(nèi)毒逡逑素耐受有關(guān)［９２】。ＲＭＯ則與Ｍ１ＭＯ、Ｍ２ＭＯ完全不同，ＩＬ４／ＩＬ－１３和ＩＦＮ－ｙ兩類(lèi)通路在逡逑ＲＭＯ激活過(guò)程中都起作用

論文邐對(duì)巨答作用？為世界衛(wèi)生組織ＷＨＯ于２０１３年公布的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，圖１－２下為國(guó)際健康風(fēng)險(xiǎn)ＢＶＧＨ于２０１５年公布的統(tǒng)計(jì)結(jié)果），人片形吸蟲(chóng)病的流行范圍幾乎遍及全帶），且呈擴(kuò)大趨勢(shì)。流行范圍的擴(kuò)大可能與全球氣候變暖、夏季降雨量激１７６］。重度流行區(qū)集中在安第斯山脈、加勒比海、北非、西歐以及里海一帶；國(guó)、日本、菲律賓和韓國(guó)為主［ｍ］。除疫源地散發(fā)病例，還有一些是通過(guò)人口流如２０１５年澳大利亞６名澳洲人從印尼旅行歸國(guó)后查出片形吸蟲(chóng)感染，推測(cè)原過(guò)疫源地的生鮮蔬菜［１７７１�，F(xiàn)代社會(huì)愈發(fā)頻繁的人口流動(dòng)（遷居、旅行、務(wù)工逡逑造成疫源地的加速擴(kuò)大的最可能因素之一。逡逑

．１宿主感染大片形吸蟲(chóng)后的肝臟組織病理學(xué)逡逑（１）水牛感染大片形吸蟲(chóng)的肝臟組織病理學(xué)觀察逡逑如圖２－１－１所示，本地水牛在感染大片形吸蟲(chóng)４邋ｗｐｉ肝組織內(nèi)即已出現(xiàn)大量的炎癥逡逑胞浸潤(rùn)；肝索排列紊亂，匯管區(qū)結(jié)締組織增生，肝小葉間質(zhì)充血；肝細(xì)胞呈現(xiàn)腫脹，逡逑的甚至出現(xiàn)了空泡變性。１０邋ｗｐｉ，炎性細(xì)胞相對(duì)減少，但仍可見(jiàn)間質(zhì)充血；結(jié)締組織逡逑近大量浸潤(rùn)纖維母細(xì)胞，并逐漸生成旋渦狀生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞，啟動(dòng)損傷組織的修復(fù)；逡逑現(xiàn)空泡的肝細(xì)胞數(shù)量下降。１４邋ｗｐｉ，先前損傷的組織局部己經(jīng)變成結(jié)構(gòu)模糊的肉芽組逡逑，這些組織周?chē)w維細(xì)胞輪廓不清晰；間質(zhì)充血減輕；肝索排列緊致，肝血竇中的紅逡逑胞和ＫＣｓ的數(shù)量明顯增多。逡逑油鏡圖（ｌＯＯＯｘ）箭頭所示為肝臟中的ＫＣｓ，經(jīng)Ｈ＆Ｅ染色后細(xì)胞核藍(lán)色深染，胞漿逡逑淺藍(lán)紫色，形狀多為不規(guī)則或橢圓，多充斥于肝索之間的肝血竇中。對(duì)比大片形吸蟲(chóng)逡逑入肝臟到定植于膽管的過(guò)程中ＫＣｓ的形態(tài)變化，可見(jiàn)４邋ｗｐｉ和１０邋ｗｐｉ感染組的ＫＣｓ逡逑為伸出偽足后的梭形或多邊形，具有徖移運(yùn)動(dòng)的趨勢(shì)；而１４邋ｗｐｉ感染組的ＫＣｓ則更逡逑向于跟對(duì)照組類(lèi)似的橢圓形或球形，推測(cè)可能與更強(qiáng)的分泌功能有關(guān)。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2770777