發(fā)布時間：2020-07-25 12:45

【摘要】：禽網狀內皮組織增生病(Reticuloendotheliosis,RE)是由禽網狀內皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起的一群病理綜合征,主要表現為生長遲緩、急性網狀細胞腫瘤和淋巴組織慢性腫瘤。REV通常與其他病毒混合感染,并易整合到宿主基因組中,再加上感染后的免疫抑制,導致RE的防控工作越來越困難。本研究旨在通過對env蛋白和gp90蛋白免疫原性的比較,從而篩選出免疫原性更好的蛋白,為RE亞單位疫苗的研究奠定基礎。首先,本研究選擇畢赤酵母表達系統(tǒng)對REV的囊膜蛋白env進行了表達,構建了含有多個Menv表達盒的重組SMD1168菌株和重組GS115菌株,在搖瓶內利用甲醇進行誘導表達。結果表明,重組env蛋白在構建的重組畢赤酵母菌株中均能成功表達,在GS115菌株中的表達量明顯超過在SMD1168菌株中的表達量;重組菌株GS115/pAO815-2Menv的表達量高于GS115/pAO815-4Menv和GS115/pAO815-6Menv的表達量,說明表達盒數量的增加對env蛋白的表達量沒有顯著的提升作用。通過對誘導條件的優(yōu)化,重組菌株GS115/pAO815-2Menv在搖瓶內的表達量可達到0.5 g/L。為了獲得大量的重組env蛋白和gp90(上清)蛋白,本研究對兩種蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了一系列的優(yōu)化,并對發(fā)酵得到的蛋白進行純化,將純化前后的蛋白分別置于室溫、4℃和-20℃保存以比較其穩(wěn)定性。結果表明,重組菌株GS115/pAO815-2Menv在29℃、pH=5.5的條件下發(fā)酵培養(yǎng),env蛋白的表達量最高,高達3.5 g/L;重組菌株SMD1168/pPIC9k-gp90在27℃、pH=6.0的條件下發(fā)酵培養(yǎng),gp90(上清)蛋白的表達量最高,高達1.1 g/L;可以通過親和層析的方法得到純度較高的重組env蛋白和gp90(菌體)蛋白,gp90(上清)蛋白通過30 kD的超濾管進行濃縮處理;三種蛋白經純化后穩(wěn)定性有所提升,但不顯著,仍存在嚴重的降解問題。通過動物攻毒保護實驗,對gp90(上清)蛋白、gp90(菌體)蛋白和env蛋白的免疫原性進行了比較。結果表明,三種蛋白均能產生較高水平的ELISA抗體和中和抗體。同時,相對于對照組的病毒載量,gp90(上清)蛋白免疫組的病毒載量降低2.36×10~5倍,gp90(菌體)蛋白免疫組的病毒載量降低6.61×10~3倍,env蛋白免疫組的病毒載量降低6.08×10~3倍。這些結果表明,三種蛋白均具備良好的免疫原性。本研究成功實現了env蛋白在畢赤酵母中的表達,并通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)的條件,可獲得大量免疫原性良好的重組蛋白,能有效保護SPF雞免受REV的感染。
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

母表達系統(tǒng)對 env 蛋白進行表達，并通過親和層定點無義突變，突變掉 env 序列中帶有的 BglⅡ和載體 pAO815；第二，利用體外構建多表達盒的方達質粒；第三，將構建的重組表達質粒分別電轉第四，通過搖瓶誘導表達，比較各重組菌株 env 于后續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)。結果表明，env 蛋白可以在畢赤達量明顯高于 SMD1168 中的表達量，其中，表在搖瓶中的 env 表達量可達 0.5 g/L。0901）重組質粒由本實驗室構建保存；大腸桿菌 存；畢赤酵母表達載體 pAO815、畢赤酵母菌株 S

業(yè)科學院碩士學位論文 第二章 禽網狀內皮組織增生病病毒 env 蛋白在畢赤酵母中3 重組酵母表達質粒的構建 Menv 的 PCR 產物進行膠回收，用 EcoRⅠ分別酶切該膠收產物和 pAO815 載體，37 對兩種酶切產物進行膠回收，并通過 T4 連接酶 16 ℃過夜連接，連接體系（10 μL） Menv 的酶切產物，1 μL 的 pAO815 載體的酶切產物，1 μL 的 10×Buffer，1 μL 的 T到的重組質粒命名為 pAO815-Menv。了體外構建含有多個 Menv 表達盒的重組表達質粒，用 BglⅡ和 BamHⅠ酶切 pAO815整的 Menv 表達盒：5 AOX1-Menv-3 AOX1(TT)；將 Menv 表達盒克隆到經 BamHⅠ5-Menv 中，得到含有兩個 Menv 表達盒的重組表達質粒 pAO815-2Menv；用 BglⅡ和 pAO815-2Menv，將兩個 Menv 表達盒同時插入經 BamHⅠ線性化的 pAO815-2Menv 中，個 Menv 表達盒的重組表達質粒 pAO815-4Menv；用同樣的方法獲得含有 6 個 Menv 表達質粒 pAO815-6Menv。將這些重組質粒轉化 Top10F 感受態(tài)。

M：DL2000 DNA Marker；1：Menv；2：陰性對照M：DL2000 DNA Marker；1：Menv；2：Negative control圖 2-3 Menv 基因的擴增Fig.2-3 PCR amplification of Menv鑒定env 轉化 Top10F 感受態(tài)，小提質粒，以 815Eco，可以獲得 1.8 kb 的 Menv 片段（圖 2-4）。用 Ec行單酶切，pAO815 酶切后只有一條 7.7kb 的條帶 7.7 kb 和 1.8 kb（圖 2-5），1.8 kb 的條帶為插入的行測序，與預期相符。

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

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相關博士學位論文 前1條

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本文編號：2769845