【摘要】：旨在建立簡單、快速的檢測體外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP的方法。本研究以含有T7啟動子、VC2GEMM-1核糖開關(guān)序列或其突變序列VC2/g20a、spinach2和tRNA序列的雙鏈DNA為模板,利用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄體系制備VC2、VC2/g20aRNA適配體。通過檢測綠色熒光強(qiáng)度分析RNA適配體對c-di-GMP和cGAMP的結(jié)合能力。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)錄得到的RNA經(jīng)過加熱變性、緩慢退火后得到VC2RNA適配體和VC2/g20a RNA適配體,在125mmol·L~(-1 )KCl和30mmol·L~(-1 )MgCl_2溶液中孵育180min的優(yōu)化結(jié)合條件下,VC2適配體與c-di-GMP特異性結(jié)合,VC2/g20a適配體與cGAMP特異性結(jié)合;c-di-GMP對VC2適配體的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)為(89±1.7)nmol·L~(-1),cGAMP對VC2/g20a適配體的半數(shù)效應(yīng)濃度為(309±4.5)nmol·L~(-1);VC2和VC2/g20a能夠分別檢測低至5nmol·L~(-1)和20nmol·L~(-1)的c-di-GMP和cGAMP;并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的RNA混合物在未純化的情況下同樣能夠檢測VC0179體外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP。這種方法可以簡單快速的檢測VC0179體外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP,并且為研究其他c-di-GMP和cGAMP合成酶活性提供潛在可能。

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本文編號：2767395