【摘要】：犬瘟熱病毒與犬細(xì)小病毒可以引起犬科、鼬科、大熊貓科等動(dòng)物的烈性傳染疾病,引起動(dòng)物的死亡率可高達(dá)80%,給我國寵物飼養(yǎng)業(yè)、皮毛動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)、野生動(dòng)物保護(hù)領(lǐng)域均帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前國內(nèi)外主要使用犬瘟熱與犬細(xì)小病毒的弱毒疫苗對(duì)疾病進(jìn)行防控,但該種類疫苗存在一些不足之處,例如生產(chǎn)成本比較高,弱毒疫苗具有毒力返強(qiáng)的隱患,面對(duì)不同的病毒變異株有其局限性等。本研究旨在構(gòu)建一款高效安全低成本的新型疫苗。我們通過將犬瘟熱與犬細(xì)小病毒的抗原基因插入到腺相關(guān)病毒(Adeno associated virus,AAV)基因組中,制備成可預(yù)防犬瘟熱與犬細(xì)小疾病的腺相關(guān)病毒重組疫苗。本課題首先選擇犬瘟熱病毒的血凝蛋白基因、融合蛋白基因和犬細(xì)小病毒的衣殼蛋白基因作為抗原基因,并分別插入到腺相關(guān)病毒基因組中。再通過腺相關(guān)病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)獲得攜帶各抗原基因的重組腺相關(guān)病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)。經(jīng)病毒滴度檢測(cè)與外源蛋白表達(dá)檢測(cè)后,將攜帶有犬瘟熱與犬細(xì)小病毒抗原基因的rAAV混合,通過肌肉注射免疫6周齡的Balb/c小鼠,同時(shí)以英特威犬二聯(lián)疫苗作為陽性對(duì)照,以rAAV-GFP病毒作為陰性對(duì)照。在首次免疫實(shí)驗(yàn)中,按照英特威犬二聯(lián)疫苗的免疫程序免疫,即對(duì)小鼠進(jìn)行三次免疫,每次免疫間隔14 d。免疫程序結(jié)束后每隔14 d對(duì)小鼠進(jìn)行采血與中和抗體的檢測(cè)。我們得到了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,之后為了進(jìn)一步驗(yàn)證rAAV疫苗的高效性,按照與三次免疫實(shí)驗(yàn)相同的免疫途徑與免疫劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行一次免疫實(shí)驗(yàn),免疫后繼續(xù)監(jiān)測(cè)中和抗體水平。三次免疫結(jié)果顯示rAAV疫苗可以使小鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體。在免疫后所有時(shí)間點(diǎn)中rAAV疫苗使小鼠產(chǎn)生的抗犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)均高于陽性對(duì)照,最高時(shí)中和抗體效價(jià)大于1:500,是陽性對(duì)照的4倍。但在免疫后的所有時(shí)間點(diǎn)中,rAAV疫苗使小鼠產(chǎn)生的抗犬細(xì)小病毒中和抗體效價(jià)均與陽性對(duì)照接近,中和抗體效價(jià)均在1:100到1:200之間,一般認(rèn)為當(dāng)中和抗體效價(jià)大于1:100時(shí)機(jī)體便可以免受強(qiáng)毒的攻擊。一次免疫結(jié)果顯示rAAV疫苗依然可以使小鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體。在免疫后第6周rAAV疫苗使小鼠產(chǎn)生的抗犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)超過1:100,然而陽性對(duì)照產(chǎn)生的抗犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)始終小于1:100,理論上我們認(rèn)為陽性對(duì)照免疫失敗,在免疫后第8周rAAV疫苗與陽性對(duì)照使小鼠產(chǎn)生的抗犬細(xì)小病毒中和抗體效價(jià)均超過1:100。在此次免疫實(shí)驗(yàn)中顯示,rAAV疫苗僅需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次免疫,理論上就可以達(dá)到對(duì)動(dòng)物的有效免疫。本研究的結(jié)果表明:rAAV疫苗可以激發(fā)小鼠的免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生高水平的中和抗體;rAAV疫苗僅需對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次免疫在理論上就可以達(dá)到對(duì)動(dòng)物的有效免疫;rAAV疫苗針對(duì)于犬瘟熱病毒和犬細(xì)小病毒產(chǎn)生的免疫效果不平衡,針對(duì)于犬瘟熱病毒的免疫效果強(qiáng)于針對(duì)犬細(xì)小病毒的免疫效果,這種現(xiàn)象可能是由抗原的選擇、rAAV病毒混合的比例與滴度等原因造成的,可在后續(xù)工作中繼續(xù)摸索病毒配比條件以更好的平衡針對(duì)兩種病毒的免疫效果。綜上所述攜帶有犬瘟熱與犬細(xì)小病毒抗原基因的腺相關(guān)病毒重組疫苗具有安全高效、縮短免疫周期、成本低廉等優(yōu)勢(shì),有望成為有效防控犬瘟熱與犬細(xì)小疾病的新型疫苗。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4
【圖文】：

1-1 犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)模式圖（Fuxiao Liu et al 201Structure of Canine Distemper Virus（Fuxiao Liu et的診斷

圖 1-3 rAAV 包裝系統(tǒng)Fig. 1-3 rAAV Packaging System的應(yīng)用型病毒，現(xiàn)階段沒有 AAV 導(dǎo)致人類疾病胞內(nèi)部穩(wěn)定表達(dá)外源基因，并且 AAV 相對(duì)和，不同血清型的 AAV 更擴(kuò)大了 AAV 的來 AAV 在基因治療領(lǐng)域和基礎(chǔ)研究領(lǐng)4）。相關(guān)病毒首次應(yīng)用于治療囊性纖維化的臨，歐洲批準(zhǔn)了基因療法藥物 Glybera，藥物關(guān)病毒，通過注射藥物入患者的腿部肌肉er 2012）；2017 年 10 月，以 AAV 為載體

elper（圖 3-2）及 pAAV-D華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。室保存；Vero 細(xì)胞系和 V驗(yàn)室趙凌教授課題組友情提點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張安定教授課題組11 株）購買于齊魯動(dòng)物保健院。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2766956